EdU細胞增殖流式檢測試劑盒

產(chǎn)品描述

細胞增殖是評價細胞活性、代謝、生理和病理狀況的重要指標。EdU (5-Ethynyl-2`- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，其連有的炔烴基團在天然化合物中很少見，能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)摻入正在復制的DNA分子中，通過基于EdU與熒光染料的特異性共軛反應，把熒光基團標記到新合成的含有EdU的DNA上面，這樣可以進行高效快速的檢測出DNA復制活性，此技術(shù)廣泛應用于細胞增殖、細胞分化、生長與發(fā)育、DNA損傷修復等方面的研究。

傳統(tǒng)的免疫熒光染色(BrdU)檢測方法需要DNA變性、抗原修復、抗原抗體過夜孵育等復雜繁瑣的操作步驟。而EdU檢測方法不需要劇烈的DNA變性，只需溫和的細胞固定化和透化處理，能夠較好地保護細胞形態(tài)、DNA整體結(jié)構(gòu)及細胞內(nèi)抗原識別位點，操作步驟更加快速、靈敏和準確。EdU與胸腺嘧啶(T)結(jié)構(gòu)非常相似，大小卻只有BrdU抗體的1/500，很容易在細胞內(nèi)擴散；無需抗原抗體反應，能在細胞和組織水平更快速便捷地反映DNA復制活性。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運輸與保存

藍冰運輸。-20℃保存，有效期12個月。

使用方法

本產(chǎn)品是采用成像檢測方法對貼壁細胞進行檢測，適用于熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡等儀器。非貼壁細胞可在孵育 EdU 后進行細胞涂片處理，固定后再采用貼壁細胞的染色流程進行檢測。也可以應用于流式細胞儀檢測。以24孔板，HK2貼壁細胞為例：

EdU標記

1.        將細胞完*培養(yǎng)基中按照 500:1的比例加入 EdU 溶液，制成 2xEdU 標記培養(yǎng)基。

2.        提前將 2xEdU 標記培養(yǎng)基預熱然后等體積加入到細胞原有培養(yǎng)基中，獲得1xEdU 溶液，其中 EdU 的終濃度為 10uM。【注】：（1）我們不建議替換全部培養(yǎng)基，因為這樣可能會影響細胞增殖的速度；（2）配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒過細胞為宜。

3.        每孔加入 300ul 含 EdU 培養(yǎng)基孵育細胞2h，棄培養(yǎng)基。【注】：（1）培養(yǎng)時間取決于細胞的增殖速度和生長狀態(tài)；（2）大多數(shù)腫瘤細胞以及粘附細胞系均可采用2h的孵育時間。

4.        以 1xPBS 清洗細胞兩次，每次5min以除去未摻入DNA的EdU殘留。【注】：貼壁不牢的細胞可降低清洗強度。

細胞的固定和通透

1.          每孔加入150ul 4%多聚甲醛細胞固定液，室溫培養(yǎng)30min，棄固定液。

2.          每孔加入150ul 2mg/ml 甘氨酸，搖床孵育5min，以中和過量的多聚甲醛。

3.          棄甘氨酸溶液，每孔加入300μ1PBS洗液，室溫清洗5min。

4.          每孔加入300ul 0.5% Triton X-100 細胞通透液，室溫通透10min，棄細胞通透溶液。

5.          每孔加入 300ul PBS 洗液，室溫清洗5min。

EDU染色

1.        通過用10：1去離子水稀釋反應緩沖液，進行配制1×反應緩沖液。

2.        按照溶解 200 mg緩沖添加劑溶于1 mL去離子水的比例稱取適量的粉末進行溶解，即為可用的緩沖添加劑的濃度，建議現(xiàn)用現(xiàn)配。【注】：緩沖添加劑為白色粉末，較難準確稱量，稱量范圍可稍微放寬，但是不應超過±20%，且該粉末較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需報廢或更換。

3.        按照以下的表格進行染色反應液的配制：

4.        每孔加入配置好的檢測混合液，體積以覆蓋細胞為宜，充分重懸細胞，避光、室溫孵育10-30 min。

5.        棄染色反應液，加入300 ul 0.5% Triton X-100 細胞滲透液清洗 2-3 次，每次 10 min。

6.        棄細胞滲透液，用 PBS 洗兩次，每次5 min。

DNA染色

1.        將Hoechst 33342 *超級純*(貨號：AC12L021)用PBS溶液1:1000進行稀釋得到終濃度為 5ug/ml 的1×Hoechst染色液。

2.        每孔加入150ul 1×Hoechst染色液，室溫避光孵育20-30 min后，棄染色液。

3.        每孔加入 300 ul PBS 洗細胞兩次，去掉洗液。

其它染色（自備）

（可選）可以根據(jù)實驗需要進行細胞表面或細胞內(nèi)抗原的抗體染色。染色完的樣品上機檢測時，根據(jù)使用的染料選擇合適的通道檢測。

圖像獲取及分析

建議染色完成后立即進行熒光顯微鏡拍照觀察;如果條件限制，請于4℃條件下避光濕潤保存3天之內(nèi)完成拍照。若為細胞爬片或涂片，可使用抗熒光淬滅封片劑進行封片后于 4°C條件下保存及拍照檢測。

注意事項

1.      本產(chǎn)品科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。