一、培養(yǎng)的細胞樣品
1、充分融解RIPA裂解液，之后混勻。取適當量的裂解液，使用前數分鐘內加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最終濃度為1mM。
2、貼壁細胞：吸除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍（如果血清中的蛋白沒有干擾，可忽略此步）。按照六孔板的每孔細胞加入150-250ul裂解液的比例加量。用槍吹打數下，使裂解液和細胞充分接觸。通常裂解液接觸細胞1-2秒后，細胞就會被裂解。
懸浮細胞：離心收集細胞，用手指彈散細胞。按照六孔板的每孔細胞加入150-250ul裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多，必需分裝成50-100萬細胞/管，然后再裂解。
3、充分裂解后，10,000-14,000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、WB和免疫沉淀等實驗。
【裂解液用量說明】：通常6孔板每孔細胞加入150μl裂解液已經足夠，如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200μl或250μl。
二、組織樣本
1、將組織jian切成細小的碎片，使用勻漿儀進行勻漿。
2、充分融解RIPA裂解液，之后混勻。取適當量的裂解液，使用前數分鐘內加入PMSF（分子量：174.2 g/mol），使其最終濃度為1mM。
3、按照每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加量?！咀⒁猓喝绻呀獠怀浞挚梢赃m當添加用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可適當降低用量?！?br style="box-sizing: border-box; -webkit-tap-highlight-color: transparent;"/>4、充分裂解后，10,000-14,000g離心3-5分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE、WB和免疫沉淀等實驗。
5、如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過高強度的漩渦混勻器使樣品裂解充分，之后使用相同步驟操作。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解的足夠充分。
【注意】：RIPA裂解液的裂解產物經常會出現一小團透明膠狀物，屬正常現象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測和基因組DNA結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散這些透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。像檢測一些常見的轉錄因子，例如NF-kB、p53，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。

RIPA裂解液（強）-20℃保存，有效期12個月。避免反復凍融，建議分裝儲存。

1、去除貼壁細胞的培養(yǎng)液時，如果血清中的蛋白沒有干擾，可以不用清洗。
2、如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量。
3、如果細胞量較多，必須分裝成 50～100 萬細胞/離心管，然后再裂解。大團的細胞較難裂解充分，而少量的細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸，相對比較容易裂解充分。
4、如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈 Vortex 使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。
5、溶解 RIPA 裂解液時，應盡量縮短溶解時間，避免裂解液中的有效成分失效。
6、裂解產物中經常會出現一小團透明膠狀物，屬正?，F象。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復合物。在不檢測和基因組 DNA 結合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉錄因子，例如 NF-KB、p53 等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子。
7、細胞裂解的操作步驟，應置于冰上或 4℃進行。
8、為了您的安全和健康，請穿戴好個人防護裝備和服裝進行操作。

溶液