游離*固醇（FC）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
可見(jiàn)分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說(shuō)明書(shū)操作。
貨號(hào)：BC1890
規(guī)格：50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 提取液：自備異丙醇，大約需要60mL，常溫保存；試劑盒內(nèi)提供一個(gè)30mL棕色空瓶，僅做分裝使用，請(qǐng)自行標(biāo)注試劑名稱。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg*固醇，臨用前加入517 μL提取液，振蕩溶解，即為50 μmol/mL的*固醇標(biāo)準(zhǔn)品，2-8℃可保存4周。

3. 工作液的配制：根據(jù)樣本量將試劑一：試劑二按9mL：60μL（約10T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：
FC是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，也是合成腎上腺皮質(zhì)激素、性激素、膽汁酸及維生素D等生理活性物質(zhì)的重要原料。FC濃度可作為脂代謝的指標(biāo)。測(cè)定原理：FC氧化酶催化FC生成4-膽甾烯酮和H₂O₂，過(guò)氧化物酶催化H₂O₂、4-氨基安*比林和酚生成紅色醌類化合物，在500nm有吸收峰，其顏色深淺與FC含量成正比。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
可見(jiàn)分光光度計(jì)、天平、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、可調(diào)式移液槍、EP管、冰、蒸餾水、異丙醇（AR，98%）。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：

1. 如果測(cè)定吸光值超過(guò)線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用提取液稀釋樣本（血清（漿）用蒸餾水稀釋）后再進(jìn)行測(cè)定。注意同步修改計(jì)算公式。

2. 提取液中含有使蛋白變性的成分，故按蛋白濃度計(jì)算時(shí)需要重新提取蛋白進(jìn)行測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1054g大鼠腎臟加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.592-0.053=0.539，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.7703x-0.0021，R²=0.9989，計(jì)算x=0.702，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

FC含量（μmol/g 質(zhì)量）=x÷W ×F =6.66 μmol/g 質(zhì)量。

1. 取5×10⁶個(gè)BNL細(xì)胞加入1mL提取液進(jìn)行超聲破碎，按照測(cè)定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.138-0.053=0.085，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.7703x-0.0021，R²=0.9989，計(jì)算x=0.113，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算含量得：

FC含量（μmol/10⁶ cell）= x÷N×F =0.0226 μmol/10⁶ cell。

1. 取人血清樣本，直接按照測(cè)定步驟操作，使用1mL玻璃比色皿測(cè)得ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A空白=0.337-0.041=0.296，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.7703x-0.0021，計(jì)算x=0.387，R²=0.9989，按血清（漿）等液體體積計(jì)算含量得：

FC含量（μmol/dL）=x×100×F =38.7 μmol/dL。
相關(guān)發(fā)表文獻(xiàn)：

1. Qin Yuan,Shang Lin,Yuan Fu,et al. Effects of extraction methods on the physicochemical characteristics and biological activities of polysaccharides from okra (Abelmoschus esculentus). International Journal of Biological Macromolecules. April 2019;127:178-186.

2. Huan Guo,Shang Lin,MinLua Jia,et al. Characterization, in vitro binding properties, and inhibitory activity on pancreatic lipase of β-glucans from different Qingke (Tibetan hulless barley) cul tivars. International Journal of Biological Macromolecules. December 2018;

3. Yao L, Chen S, Li W. Fatostatin inhibits the development of endometrial carcinoma in endometrial carcinoma cells and a xenograft model by targeting lipid metabolism[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2020: 108327.

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