熒光定量PCR儀所用到的實時熒光定量PCR技術(shù)是通過對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，而實現(xiàn)對起始模板定量及定性分析的目的。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖，達(dá)到監(jiān)測PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量的目的。

　　一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段、熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級增加，PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，因此根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，故選擇該階段進(jìn)行定量分析。為了較方便的進(jìn)行DNA拷貝數(shù)的定量，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了三個非常重要的概念：基線、熒光閾值和Ct值。

　　基線：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的初數(shù)個循環(huán)里，熒光信號變化不大，接近于一條直線，該直線即是基線。

　　熒光域值：一般將PCR反應(yīng)前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值是PCR反應(yīng)3-15個循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。

　　Ct值：表示每個PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)難曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

　　熒光定量PCR儀的實時熒光定量PCR技術(shù)是DNA定量技術(shù)的一次飛躍。運(yùn)用該項技術(shù)我們可以對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析。定量分析包括jue對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。除此之外還可以對PCR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析，利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及SNP檢測等。目前實時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域，其中主要的應(yīng)用集中在以下幾個方面：

　　1.DNA或RNA的jue對定量分析。包括病原微生物或病毒含量的檢測，轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等。

　　2.基因表達(dá)差異分析。如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異(如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等)，特定基因在不同時相的表達(dá)差異以及cDNA芯片或差顯結(jié)果的確證。

　　3.基因分型。例如SNP檢測，甲基化檢測等。