常規(guī)高通量測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建，需要PCR擴(kuò)增。主要是為了對(duì)微量DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，提高庫(kù)容；另一方面，放大核酸熒光信號(hào)，提高測(cè)序準(zhǔn)確度。然而，PCR擴(kuò)增同樣也有著無(wú)法忽視一些問(wèn)題：

1.      擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生復(fù)制錯(cuò)誤，累積下去，產(chǎn)生假陽(yáng)性；

2.      擴(kuò)增會(huì)有一定的偏好性，比如GC含量異常的區(qū)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)等區(qū)域，擴(kuò)增效率低，難以覆蓋；

3.      擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)越多，重復(fù)率（Duplication）越高，造成測(cè)序成本增加、浪費(fèi)測(cè)序數(shù)據(jù)。

什么是PCR-Free技術(shù)

常規(guī)擴(kuò)增建庫(kù)有諸多問(wèn)題，那么PCR-Free技術(shù)也就營(yíng)運(yùn)而生。PCR-Free技術(shù)，相較于常規(guī)建庫(kù)，其建庫(kù)步驟為：基因組片段化-末端修復(fù)-加接頭-純化-文庫(kù)質(zhì)控，省去了PCR擴(kuò)增的步驟。

1.      PCR-Free建庫(kù)技術(shù)：

2.      省去擴(kuò)增步驟，縮短建庫(kù)時(shí)間；

3.      避免使用高保真聚合酶，降低建庫(kù)成本；

4.      減少擴(kuò)增產(chǎn)生的復(fù)制錯(cuò)誤；

5.      避免擴(kuò)增偏好性；

6.      避免擴(kuò)增產(chǎn)生的Duplication，降低測(cè)序成本。

llumina DNA PCR-Free Prep，Tagmentation DNA建庫(kù)即運(yùn)用了PCR-free的建庫(kù)方式，并同時(shí)采用創(chuàng)新型鏈接在磁珠上的轉(zhuǎn)座酶（BLT），將接頭連接和DNA 片段化結(jié)合到一個(gè)簡(jiǎn)單快速的反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)WGS高度均勻的覆蓋。

針對(duì)PCR-Free建庫(kù)方法，我們推出了基于Biomek i7工作站的Illumina DNA PCR free文庫(kù)構(gòu)建自動(dòng)化方案，該方案可使用低投入量（25-99ng）或標(biāo)準(zhǔn)投入量（100-2000ng）gDNA進(jìn)行建庫(kù)，同時(shí)進(jìn)行96例樣本的建庫(kù)。

·        減少手動(dòng)操作時(shí)間

·        減少系統(tǒng)設(shè)置何潛在的移液錯(cuò)誤

·        標(biāo)準(zhǔn)化工作流程改進(jìn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

·        快速安裝

Biomek i7工作站

圖1. Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation工作桌面

·        集成了96通道移液頭與靈活8通道移液頭；

·        靈活8通道可配置固定針和可替換吸頭通道搭配；

·        96通道可選擇上一列、一行、多行等不規(guī)則形狀排列吸頭，實(shí)現(xiàn)不定樣本數(shù)液體轉(zhuǎn)移；

·        斜側(cè)抓板機(jī)械手可360度旋轉(zhuǎn)，輕松實(shí)現(xiàn)臺(tái)面全覆蓋；

·        多達(dá)45個(gè)工作板位；

·        可實(shí)現(xiàn)震蕩、加熱/冷卻、吸頭清洗等功能；

·        開放式工作桌面，可輕松整合外部設(shè)備，如（自動(dòng)PCR儀）。

圖2. Illumina PCR free DNA Library Prep 自動(dòng)化工作流

使用Biomek i7工作站進(jìn)行 Illumina PCR free文庫(kù)構(gòu)建，輕松解放雙手，把更多的活交給工作站來(lái)進(jìn)行

表1.  Biomek i7 Hybrid Genomics Workstation自動(dòng)化Illumina PCR free流程預(yù)估時(shí)間（大于100ng gDNA投入）

Method Options Selector (MOS）

MOS能夠選擇樣本數(shù)量、投入量、Index開始使用位置，以最大限度地提高靈活性、適應(yīng)性和方法執(zhí)行的簡(jiǎn)易性。

圖3. Illumina PCR-Free建庫(kù)方法選項(xiàng)選擇器

Guided Labware Setup (GLS)

GLS基于MOS中選擇的選項(xiàng)生成的，并提供用戶特定的圖形設(shè)置說(shuō)明，包括試劑體積計(jì)算和準(zhǔn)備試劑的分步說(shuō)明。

圖4. 引導(dǎo)式實(shí)驗(yàn)室設(shè)置提供配方注釋，指示試劑量（上圖），

并指導(dǎo)用戶正確設(shè)置平臺(tái)（下圖）

DeckOptixFinal Check (DFC)

在開始運(yùn)行自動(dòng)化流程之前，BML中的DFC功能，會(huì)通過(guò)實(shí)時(shí)拍照的方式分析工作桌面耗材擺放，以減少設(shè)置錯(cuò)誤，例如吸頭、深孔板擺放位置錯(cuò)誤。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了證明在i7雙雜交工作站上進(jìn)行96個(gè)樣品文庫(kù)制備的能力，我們從人細(xì)胞系NA12878 gDNA制備文庫(kù)。將起始濃度為150 ng、300 ng、400 ng、500 ng和750 ng的48個(gè)gDNA樣本以及陰性模板對(duì)照（NTC）隨機(jī)放入96孔板，如下所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

·        隨機(jī)挑取了23個(gè) gDNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，平均插入片段為483bp±28bp

·        Reads mapping率為96.8%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%

Biomek i7工作站上的Illumina  PCR free DNA文庫(kù)制備自動(dòng)化是一個(gè)獨(dú)立的解決方案，為任何規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室提供了高效、靈活和可擴(kuò)展的解決方案。自動(dòng)化解決方案提供的文庫(kù)在下游工作流程中產(chǎn)生高質(zhì)量的結(jié)果，并節(jié)省了寶貴的時(shí)間和金錢。