BeNano靜態(tài)流動模式適用于與凝膠滲透色譜GPC/SEC連接使用，其中GPC設備可以配置一個示差折光檢測器或者一個紫外檢測器，可以依賴于樣品組分的大小將每個組分分離，并依次流出。

BeNano靜態(tài)流動模式在90°使用PD檢測器收集樣品散射光強度信號，并同時收集示差折光檢測器或者紫外檢測器信號，結合這兩個信號計算得到每個流出組分的絕對分子量和分子量分布信息。由于BeNano采用的是單角度靜態(tài)光散射，根據瑞利散射理論只要分子大小不超過波長1/40，結果的準確性都能夠得到保證，這尤其適合對于蛋白質類樣品的檢測。

在這個應用中，我們將BeNano主機與SEC前端相連接，檢測了單克隆抗體IgG樣品的分子量和分子量分布信息。

原理和設備

?前端凝膠色譜中使用了市場中某主流品牌SEC，具有RI檢測器，使用TSK氧化硅柱進行分離。

采用丹東百特公司的BeNano 180 Zeta Max納米粒度及Zeta電位分析儀進行測試，儀器使用波長671nm，功率50mW激光器作為光源，在90°進行光散射信號收集。測試使用了27μL低容量流通池作為檢測池。利用BFC-1信號采集器收集前端SEC設備的示差折光檢測器輸出的模擬信號。

樣品制備和測試條件

將2mg/mL的IgG分散在pH=7的PBS緩沖液中，配置濃度為5mg/mL。進樣量100μL，流速為0.7mL/min。

通過前端SEC進行進樣，分離。分離后的樣品組分逐一進入RI檢測器和BeNano進行信號收集。BeNano溫度控制在25℃，基本與室溫一致。

測試結果和討論

圖1. IgG色譜流出曲線

圖2. IgG分子量流出曲線

圖1中可以看出，IgG經過色譜柱分離得到若干個流出峰，說明IgG在PBS中形成一系列團聚狀態(tài)。對于RI和光散射信號進行基線設定和積分線設定，得到每一個峰對應的分子量，得到的分子量列于表1中。

圖2為對于整體信號積分得到整體分子量流出曲線。通過分子量隨流出體積曲線可以看出，分子量隨著流出體積逐漸降低，這符合凝膠色譜的分離原理。在每一個峰內，分子量均形成平臺，這符合蛋白質每個峰內某種寡聚狀態(tài)的分子量都分布極窄的特征。

表1. IgG峰內分子量Mw結果

通過表1每個峰的分子量可以看出，峰1（最后的流出峰）的分子量為150K，這與IgG的理論分子量一致，峰2-3的分子量均為峰1的倍數，說明峰2-3分別為二聚體和三聚體。從含量中可以看出，單體含量75.8%占大部分含量，但是其他團聚成分的含量總和超過了5%，若此種單抗藥物為注射使用應當特別注意其可能產生的免疫原性的副作用。

結論

在該應用報告中，利用BeNano靜態(tài)流動模式檢測了IgG樣品的分子量信息，通過結果可以看出，BeNano靜態(tài)流動模式可以分別準確地得到一系列IgG樣品流出峰的分子量，通過分子量值可以準確判斷出各個流出峰對應的團聚狀態(tài)。

生物類藥品中的團聚物的存在會影響其療效和用藥風險，大的團聚物會引起人體免疫源性的反應，因此對于單抗類藥物中團聚物的種類和含量的識別非常重要。BenNano靜態(tài)流動模式對于單抗的檢測結果表明，通過靜態(tài)光散射流動模式可以清晰地分辨出單抗的團聚物種類并計算出其有效含量。這對于生物藥研發(fā)具有重要意義。