人表皮生長因子ELISA試劑盒,beta-urogastrone, EGF, epidermal growth factor (beta-urogastrone), epidermal growth factor, HOMG4, pro-epidermal growth factor, URG, Urogastrone

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測技術。特異性抗人EGF抗體預包被在高親和力的酶標板上。酶標板孔中加入標準品、待測樣本和生wu素化的檢測抗體，經(jīng)過孵育，樣本中存在的EGF與固相抗體和檢測抗體結合，形成免疫復合物。洗滌去除未結合的物質(zhì)后，加入辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）。洗滌后，加入顯色底物，避光顯色。加入終止液終止反應，在450nm波長（參考校正波長540nm或570nm）測定吸光度值。

Human

3.9pg/mL-250pg/mL

需自備試驗器材
1. 酶標儀（可測量450nm檢測波長的吸收值及540nm或570nm校正波長的吸收值）
2. 高精度加液器及一次性吸頭
3. 蒸餾水或去離子水
4. 洗瓶（噴瓶）、多通道洗板器或自動洗板機
5. 500mL量筒

一、實驗前準備
1. 樣品搜集及儲存
①細胞培養(yǎng)上清：顆粒物應通過離心去除；立刻檢測樣本。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
②血清：使用血清分離管（SST）收集樣本，樣品室溫放置30分鐘。離心15分鐘，轉速為1000g。立即取出血清，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
③血漿：使用EDTA、肝素或檸檬酸作為抗凝血劑收集血漿，在收集后30分鐘內(nèi)離心15分鐘，轉速為1000g，并立即檢測。樣本收集后若不及時檢測，建議按一次使用量分裝，凍存于≤-20℃冰箱內(nèi)，避免反復凍融。樣本可能需要用稀釋劑（1×）稀釋。
2. 試劑配制（使用前請將所有試劑和樣本放置于室溫，靜置 15 分鐘。建議所有的實驗樣本和標準品做復孔檢測）
①1×洗滌液配制：試劑盒中的濃縮洗滌液為20×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋為1×工作液。例：取10mL濃縮洗滌液+190mL蒸餾水定容至200mL，實際操作時可先計算使用量，再進行配制。
②1×稀釋用緩沖液配制：試劑盒中的濃縮稀釋用緩沖液為10×母液，使用前需使用蒸餾水稀釋至1×工作液。例：取3mL濃縮稀釋用緩沖液+27mL蒸餾水定容至30mL。實際操作時可先依據(jù)樣本稀釋倍數(shù)，計算所需的稀釋用緩沖液用量，再進行配制。
③檢測抗體：將干粉離心至管底，使用110uL稀釋用緩沖液（1×）溶解，室溫靜置5分鐘后得到100×母液；使用前需稀釋為1×工作液。按照每孔用量100uL計算所需體積。例：使用了10個孔，則取10uL的100倍工作濃度的檢測抗體，使用稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
④SA-HRP：SA-HRP為40×母液，使用前需使用稀釋緩沖液（1×）稀釋配制成1×工作液，每孔所需量為100uL。例：使用了10個孔，則取25uL的40×母液+975uL稀釋用緩沖液（1×）定容至1mL，得到1mL的1×工作濃度的檢測抗體。
⑤顯色液：按每孔100uL，計算當次試驗所需要用量，取出相應體積的顯色液，避光；取出的顯色液僅供當日使用。
⑥標準品：凍干標準品用稀釋用緩沖液（1×）重溶，重溶體積1000uL，得到濃度為250pg/mL標準品母液。輕輕震搖至少5分鐘，其充分溶解。每個稀釋管中加入300uL稀釋用緩沖液（1×）。將標準品母液參照下圖做系列稀釋，每管須充分混勻后再移液到下一管。沒有稀釋的標準品母液可用作標準曲線最高點（250pg/mL），稀釋用緩沖液（1×）可用作標準曲線零點（0pg/mL）。



二、操作步驟
1. 準備好所有需要的試劑和標準品；
2. 從已平衡至室溫的密封袋中取出微孔板，未用的板條請放回鋁箔袋內(nèi)，重新封口；
3. 向微孔板中加入300uL洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液在吸水紙上將微孔板拍干，請立即使用不要讓微孔板干燥；
4. 分別將不同濃度標準品，實驗樣本或者質(zhì)控品加入相應孔中，每孔100uL。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時;
5. 將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加洗滌液300uL，然后將板內(nèi)洗滌液吸去。重復操作3次。每次洗板盡量吸去殘留液體會有助于得到好的實驗結果。最后一次洗板結束，請將板內(nèi)所有液體吸干或將板倒置，在吸水紙拍干所有殘留液體；
6. 在每個微孔內(nèi)加入100uL檢測抗體。用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時；
7. 重復第5步洗板操作；
8. 在每個微孔內(nèi)加入100uLSA-HRP，室溫孵育20分鐘。注意避光；
9. 重復第5步洗板操作；
10. 在每個微孔內(nèi)加入100uL顯色液，室溫孵育5-30分鐘，注意避光；
11. 在每個微孔內(nèi)加入50uL終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。如果溶液顏色變?yōu)榫G色或者顏色變化不一致，請輕拍微孔板，使溶液混合均勻；
12. 加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。如果沒有使用雙波長校正，結果準確度可能會受影響；
13. 計算結果：將每個標準品和樣品的校正吸光度值(OD450-OD540或OD570)、復孔讀數(shù)取平均值，然后減去平均零標準品OD值。使用計算機軟件作四參數(shù)邏輯(4-PL)曲線擬合創(chuàng)建標準曲線。另一種方法是，可以通過繪制標準品濃度做對數(shù)與相應OD值對數(shù)生成曲線，并通過回歸分析確定最佳擬合線。這個過程可生成一個足夠使用但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。若樣本經(jīng)過稀釋，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。
注：提供的標準曲線數(shù)據(jù)僅供參考，應根據(jù)同次試驗所繪標準曲線計算樣本含量。

三、試劑盒參數(shù)
1. 回收率：在細胞培養(yǎng)基樣本中摻入不同水平的Human EGF， 測定其回收率。 回收率范圍在96-103%，平均回收率在99%。 
2. 靈敏度：Human EGF的zui低可測劑量（MDD）一般在0.089-0.740pg/mL。zui低可測值是根據(jù)20個標準曲線零點吸光值的平均值加兩倍標準差計算得到的相對應濃度。
3. 校正：此 ELISA 試劑盒經(jīng)sf-21昆蟲細胞表達的高純度重組Human EGF蛋白所校正。
4. 線性：4個不同的樣本中摻入高濃度的Human EGF，然后用稀釋劑（1×）將樣本稀釋到檢測范圍內(nèi)，測定其線性。

5. 特異性：此ELISA法可檢測天然及重組Human EGF蛋白。將以下因子用稀釋劑（1×）配制成50ng/mL的濃度來檢測與Human EGF的交叉反應。將50ng/mL的干擾因子摻入中間范圍的重組Human EGF對照品中，來檢測對Human EGF的干擾。沒有觀察到明顯的交叉反應或干擾。與重組Human Pro-EGF交叉反應約2.3%。

四、常見問題解析
1. 白板（顯色完成后，無顏色出現(xiàn)）

2. 花板（空白、陰性陽性對照正常，但標本孔OD值明顯偏高）

五、實驗流程圖

EGF（表皮生長因子，又稱Urogastrone）前體是生長因子EGF家族的Group I成員，分子量為185kDa。Group I成員是結合并活化表皮生長因子受體（EGFR）的分子。EGF家族成員被合成為I型跨膜（TM）蛋白，且由蛋白水解生成可溶形式。人表皮生長因子（EGF）是一個長為1185個氨基酸前體分子形式的一個片段，包含1010個氨基酸細胞外區(qū)域、21個氨基酸TM區(qū)域和153個氨基酸胞質(zhì)域。這個前體的胞外域（ECD）有三個主要的結構模塊。其中包括9個BLDLR重復、1個血管性血友病因子A區(qū)域和9個類EGF重復，并在近膜區(qū)包含了成熟EGF分子的53個氨基酸的結構（為前體形式的第971位至1023位氨基酸）。這個跨膜185kDa的亞型（氨基酸21-1023），存在于大多數(shù)體液中。這個過程同時產(chǎn)生了大量40-100kDa的蛋白片段，可能為蛋白水解降解產(chǎn)物。6kDa成熟EGF亞型的產(chǎn)生過程尚不清楚。它可能源自細胞內(nèi)部，也可能源于細胞表面，通過細胞表面的膜結合絲氨suan酶水解可溶性的160kDa前體或這個前體水解以后生產(chǎn)的70kDa的分子亞型而來。
值得注意的是，成熟形式的EGF、185kDa跨膜蛋白、已被水解但尚未加工的循環(huán)型分子和160kDa前體分子都具有生物學活性。而這些生物學活性主要是因為有EGF肽段嵌入在這些前體分子中。其它類型EGF的修飾都不具備結合EGF受體的活性。編碼EGF的基因在表達EGF蛋白過程中存在4種可能的剪切體，但都不影響成熟EGF的序列。其中兩種剪切體發(fā)生在胞外區(qū)序列，分別刪除了第913位至953位的氨基酸和第314至355位的氨基酸。另外兩種剪切體則涉及EGF的胞內(nèi)區(qū)域，分別以12個氨基酸替換了第1125位至1207位的氨基酸和以17個氨基酸替換了第1136-1207位的氨基酸。成熟的人EGF與小鼠、大鼠和豬的EGF的同源性分別是70%、70%和85%。已知表達EGF的細胞包括血小板、大腦神經(jīng)元、星狀膠質(zhì)細胞和小腦浦肯野細胞、布魯納細胞（十二指腸）和頜下腺細胞、不著色的纖毛上皮和垂體前葉細胞。EGF有許多不同的生理作用。目前廣泛認可的EGF功能主要基于EGF受體-配體的結合而實現(xiàn)。而EGF受體也能和其它EGF家族的蛋白結合，進而形成異源多聚體并與其它EGF受體家族成員二聚化，或者和其它跨膜蛋白如PDGFR和HGF受體產(chǎn)生關聯(lián)。在任何一種情況下，EGF都可以對胎兒和成人組織產(chǎn)生作用。在胎兒，EGF影響雙陰性-雙陽性階段的胸腺細胞生長和分化。在神經(jīng)元形成過程中，EGF似乎也可以刺激神經(jīng)膠質(zhì)神經(jīng)元的生成并促進其上皮化。最后，它能抑制脂肪細胞的成熟，從而增加前脂肪細胞數(shù)量。在成人，EGF可以在乳腺的乳生成過程中發(fā)揮作用，也可使纖維細胞有絲分裂，ECM離解和遷移，廣泛地影響生長因子相關的各種作用。
EGF受體即表皮生長因子受體（也稱為HER1和ErbB1），其激活機制尚不明確。目前的研究認為每一個EGF分子和一個EGF受體分子有兩個結合位點，這會迫使受體產(chǎn)生構象變化，而和第二個EGF-EGFR復合物結合。這種二聚體即具有實際功能的EGF受體。ErbB2也可以和EGF受體形成異源二聚體，但不能和EGF結合。這可能是因為ErbB2天然以二聚體的形式存在，掩蓋了其配體結合的位點，而使配體無法與其結合。因此，它需要結合一個已經(jīng)激活的EGF-EGFR復合體才能形成一個功能性的EGF受體。而由于內(nèi)在的靜電斥力作用，ErbB2自身無法形成同源二聚體。EGF也只有在高濃度的環(huán)境下也能和ErbB3：ErbB2形成異源多聚體。這個過程的重要性，目前仍是未知的。EGFR的選擇性剪切亞型存在于腫瘤細胞中，并可能參與腫瘤發(fā)生或使細胞對EGF受體抑制劑敏感。

Human

未開封試劑盒，2-8°C儲存。