1、JC-1染色工作液的配制
六孔板每孔所需JC-1染色工作液的量為1mL，其他培養(yǎng)器皿的JC-1染色工作液的用量以此類推：對于細胞懸液每50～100萬細胞需0.5mLJC-1染色工作液。取適量JC-1（200×），按照每50μLJC-1（200×）加入8mL超純水的比例稀釋JC-1。劇烈震蕩充分溶解并混勻JC-1。然后再加入2mLJC-1染色緩沖液（5×），混勻后即為JC-1染色工作液。

2、陽性對照的設置：
把試劑盒中提供的CCCP（10mM）推薦按照1∶1000的比例加入到細胞培養(yǎng)液中，稀釋至10μM，處理細胞20分鐘。隨后按照下述方法裝載JC-1，進行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細胞，通常10μMCCCP處理20分鐘后線粒體的膜電位會wan全喪失，JC-1染色后觀察應呈綠色熒光；而正常的細胞經(jīng)JC-1染色后應顯示紅色熒光。對于特定的細胞，CCCP的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關文獻資料決定。

3、對于懸浮細胞
取10～60萬細胞，重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中，細胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。
加入0.5mLJC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育結束后，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。
用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次：加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。
再加入1mLJC-1染色緩沖液（1×）重懸細胞，600g4℃離心3～4分鐘，沉淀細胞，棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細胞儀分析。

4、對于貼壁細胞
注意：對于貼壁細胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細胞儀檢測，可以先收集細胞，重懸后參考懸浮細胞的檢測方法。
對于六孔板的一個孔，吸除培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用PBS或其它適當溶液洗滌細胞一次，加入1mL細胞培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。加入1mLJC-1染色工作液，充分混勻。細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20分鐘。
在孵育期間，按照每1mLJC-1染色緩沖液（5×）加入4mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。
37℃孵育結束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。
加入2mL細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。
熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

5、對于純化的線粒體
把配制好的JC-1染色工作液再用JC-1染色緩沖液（1×）稀釋5倍。
0.9mL5倍稀釋的JC-1染色工作液中加入0.1mL總蛋白量為10～100μg純化的線粒體。用熒光分光光度計或熒光酶標儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進行時間掃描（timescan），激發(fā)波長為485nm，發(fā)射波長為590nm。如果使用熒光酶標儀，激發(fā)波長不能設置為485nm時，可以在475～520nm范圍內(nèi)設置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟6中的波長設置進行熒光檢測。
用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟6。

6、熒光觀測和結果分析檢測
JC-1單體時可以把激發(fā)光設置為490nm，發(fā)射光設置為530nm；檢測JC-1聚合物時，可以把激發(fā)光設置為525nm，發(fā)射光設置為590nm。注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設置在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測JC-1單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設置，如觀察GFP或FITC時的設置；檢測JC-1聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或Cy3時的設置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細胞很可能處于細胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細胞的狀態(tài)也比較正常。

4℃避光保存，有效期一年