一、實(shí)驗(yàn)材料（自備）
PBS 緩沖液（1×，pH~7.4）
0.4% Triton X-100（PBS 配制） 
0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）
4%多聚甲醛（PBS 配制）
免疫組化筆
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
石蠟切片處理相關(guān)試劑
抗熒光淬滅封片劑
ddH2O
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
A.陽(yáng)性對(duì)照：
DNase I 處理制備陽(yáng)性對(duì)照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA暴露3'-OH末端，人為造成細(xì)胞凋亡。每次實(shí)驗(yàn)做一次即可。（用來驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無問題）
B.陰性對(duì)照：
使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH2O替代 TdT Enzyme。（主要是排除細(xì)胞自身凋亡、操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧?；以及調(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度。）
C.實(shí)驗(yàn)處理組。
實(shí)驗(yàn)組按照說明書正常操作。
D.實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。
實(shí)驗(yàn)組按照說明書正常操作。
三、實(shí)驗(yàn)步驟:
1、樣本準(zhǔn)備：
（1）對(duì)于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片
a. PBS 清洗 1 次。
注：如果擔(dān)心細(xì)胞涂片的細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。
b. 固定：加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制），4°C固定 30 min。PBS 清洗 2 次。
c. 通透：加入適量0.4% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。PBS清洗2次。
d.轉(zhuǎn)步驟 2. TUNEL 反應(yīng)。

（2）對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
a. 收集細(xì)胞（ 3-5×106個(gè)細(xì)胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。 
b. 固定：加入適量4%多聚甲醛（PBS配制）充分重懸細(xì)胞，4℃固定30 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。 
c. 通透：加入適量0.4% Triton X-100（PBS 配制），室溫通透20 min。2000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。 
d. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。 

（3）石蠟組織切片
a. 將石蠟切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60min。 
b. 脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯I（10 min）→ 二甲苯II（10 min）→ 100％乙醇I（5 min）→ 100％乙醇II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→ 70%乙醇（5 min）→ ddH2O沖洗5 min，沖洗2次。 
注：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中進(jìn)行此操作。 
c. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。 
注：若在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫。 
d. 通透：按1: 50 的比例，將2 mg/mL的Proteinase K 溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育30 min。 
注：Proteinase K 可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K 的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。 
e. 將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。 
注：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。 
f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。 

（4）冰凍組織切片
a. 固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。將切片樣本浸入4%多聚甲醛（PBS配制）中，室溫固定30 min。將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次10 min。 
注：若是擔(dān)心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果。可在甲醛固定完成后加入適量2 mg/mL 甘氨suan清洗 10 min，中和殘留的固定液，再進(jìn)行PBS清洗。 
b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。 
注：若在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫。 
c. 通透：按1:50的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育20 min。 
注：Proteinase K 可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K 的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。如優(yōu)化Proteinase K的濃度與孵育時(shí)間仍無法改善染色效果，可選擇將樣本浸入1%Triton X-100（PBS 配制）中，室溫促滲 3-5 min；之后將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次 5 min。 
d. 將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤(rùn)。 

（5）陽(yáng)性處理（僅陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行 TUNEL 反應(yīng)步驟）
a. 按1: 10的比例用ddH2O將10× DNase I Buffer 稀釋成1× DNase I Buffer 備用。
b. 滴加100 µL 1× DNase I Buffer 到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡5 min。
c. 用1× DNase I Buffer 以 1: 100 稀釋 DNase I (2 U/μL)至終濃度 20 U/mL的工作液。
d. 棄去Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵育15 min。
e. 棄去DNase I 工作液，PBS清洗2次。
f. 轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。
2、TUNEL 反應(yīng)
（1）配制 TUNEL 反應(yīng)液（即用即配）：

（2）對(duì)于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片
a.每個(gè)樣本加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時(shí)間（細(xì)胞推薦染色時(shí)間 15-30min，組織染色時(shí)間推薦 1 h）。 
注：50 μL TUNEL 反應(yīng)液適合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以適當(dāng)調(diào)整 TUNEL 反應(yīng)液體積，覆蓋細(xì)胞即可）。如果待檢測(cè)的樣品為涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL 反應(yīng)液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL 反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL 反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。 
b. 棄去 TUNEL 反應(yīng)液，PBS 清洗 2 次后，再用 0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）清洗 3 次，每次 5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。 
c.（可選）每個(gè)樣本加入適量濃度為 5 μg/mL 的 DAPI 染液，室溫避光孵育 5 min。染色完成后，棄去 DAPI 染液，PBS 清洗2 次，每次 5 min。 
d.（可選）切片封片：每個(gè)樣本滴加 20 μL 抗熒光淬滅封片劑（抗熒光淬滅封片劑可能會(huì)不適用于某些染料，實(shí)驗(yàn)前建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片wan全。
e. 用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加 100 μL PBS 保持樣本濕潤(rùn)，立即在熒光顯微鏡下觀察。

（3）對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
a.每個(gè)樣本管加入50 μL TUNEL反應(yīng)液輕輕重懸細(xì)胞，37℃避光孵育15-30min。每隔10 min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。
b. 2000 rpm 離心 5 min，棄去 TUNEL 反應(yīng)液，用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5 mg/mL BSA）清洗2次，每次 5 min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。 
c. 每個(gè)樣本管加入100 μL濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5 min。
d. 加入400 μL PBS重懸細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)或進(jìn)行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

-20℃保存，組分 A 需避光，避免反復(fù)凍融。