盡管作者之前用于識(shí)別酵母基因的人類基因替代型變異的篩選策略取得了成功，但該策略繁瑣且僅鑒定出 2 個(gè)抑制子（Kachroo 等人，2015 年）。該技術(shù)需要人工分離菌落，然后進(jìn)行四分體分離，而且鑒定抑制子需要人工篩選數(shù)百個(gè)酵母菌落。因此，作者開發(fā)了一種新的流程，以自動(dòng)化高通量的方式篩選抑制子質(zhì)粒（圖 1a）。

作者特別專注于篩選非互補(bǔ)的人類 β2c（HsPSMB7）蛋白中的抑制子突變，這是一種組成型表達(dá)的蛋白酶體亞基。該方法能夠在顯著縮短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大規(guī)模且無(wú)誤的篩選。實(shí)驗(yàn)采用 96 孔板形式進(jìn)行，并通過(guò)合成遺傳陣列（SGA）或 MM 選擇法分離單倍體特異性突變體，從而無(wú)需進(jìn)行四分體分離（Pan 等人，2004 年；Kuzmin 等人，2016 年）。通過(guò)使用 5-FOA 選擇的質(zhì)粒依賴性測(cè)定，證實(shí)了互補(bǔ)作用與基于 URA3 的質(zhì)粒上的變異人類基因相關(guān)。利用這一策略，作者成功獲得了 HsPSMB7 基因中的多個(gè)可替換的抑制突變。在整篇論文中，作者始終使用“功能替換”、“可替換性”或“可替換能力”這些術(shù)語(yǔ)來(lái)指代人類基因或其變異體補(bǔ)償其酵母同源基因功能的能力。該篩選流程是基于多項(xiàng)考慮因素而開發(fā)的。野生型人類 PSMB7（β2c）無(wú)法替代同源的酵母 β2 基因 ScPUP1，這一點(diǎn)從選擇性剔除酵母基因時(shí)觀察到的致死表型中可以得到證明（圖 1b，補(bǔ)充圖 1b）（卡赫羅等，2015 年）。相比之下，如果人類基因（或其變體）成功替代宿主基因的功能，該菌株將能夠生長(zhǎng)，從而作為功能替代的簡(jiǎn)單檢測(cè)指標(biāo)。錯(cuò)誤率較高的 PCR 策略在帶有 URA3 標(biāo)記的酵母表達(dá)載體中生成了一個(gè) HsPSMB7 突變基因庫(kù)，每個(gè)基因平均有 1 至 4 個(gè)突變（圖 1a）。

為了確定任何突變的 PSMB7 等位基因是否能夠彌補(bǔ)刪除同源酵母基因所導(dǎo)致的致死性，作者將突變基因庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母二倍體 HetKO PUP1/pup1Δ：：kanMX 菌株中（Pan 等人，2004 年）。轉(zhuǎn)化方案被擴(kuò)展以獲得數(shù)千個(gè)彼此分離的酵母菌落，每個(gè)菌落攜帶不同的 PSMB7 突變基因質(zhì)粒（圖 1b）。使用 QPix 460 以自動(dòng)化方式選取了數(shù)千個(gè)菌落，并以 96 孔格式將其接種到預(yù)孢子化 GNA 培養(yǎng)基上，并通過(guò) G418 選擇法對(duì)帶有 kanMX 標(biāo)記的 pup1Δ 進(jìn)行篩選。孢子形成后，在 MM 培養(yǎng)基（不含 Leu、Arg、His、Ura 和 CAN）中能夠選擇出攜帶不同人類 PSMB7 等位基因的可存活的 pup1Δ：：kanMX 單倍體酵母孢子（在存在 G418 的情況下）（圖 1c，底部面板）。作為孢子形成效率的內(nèi)部對(duì)照，作者還測(cè)試了野生型 PUP1 單倍體孢子在 MM 培養(yǎng)基（不含 G418）上的生長(zhǎng)情況（圖 1c，頂部面板）。篩選結(jié)果顯示，在 MM + G418 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的 19 個(gè)菌落（圖 1d 中的代表性圖像）可能攜帶互補(bǔ)的人類 PSMB7 變體。然后對(duì)這些單倍體抑制突變體進(jìn)行測(cè)試，以確定抑制是否是由于攜帶質(zhì)粒中的人類突變基因所致。根據(jù)對(duì) 5-FOA 的缺乏生長(zhǎng)（這會(huì)抑制 URA3 基因）來(lái)測(cè)試酵母細(xì)胞的質(zhì)粒依賴性。這 19 個(gè)抑制突變體中有 7 個(gè)在 5-FOA 培養(yǎng)基上無(wú)法存活，這表明這些菌株中的人類基因變體對(duì)于其存活是必需的（圖 1d）。

理想情況下，將酵母菌人源化以功能表征人類基因?qū)⒗媒湍妇械囊吧腿祟惖任换?。然而，抑制子篩選和 c 末端尾部交換數(shù)據(jù)表明，人類 β2c 需要突變與鄰近的酵母亞基相互作用，特別是 Scβ3，才能正確地組裝到酵母 CP 中。因此，恢復(fù)這些人類特異性亞基相互作用的策略可能使野生型 HsPSMB7 整合到酵母蛋白酶體中。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者詢問(wèn)野生型人類 β2c 是否可以在功能上取代菌株中的酵母對(duì)應(yīng)物。作者開發(fā)了一種基于 CRISPR-Cas9 的方法來(lái)靶向酵母的 ScPUP1 (β2) 和 ScPUP3 (β3) 基因。表達(dá) Cas9-sgRNAScPUP1 或 Cas9-sgRNAScPUP3 的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母會(huì)導(dǎo)致其死亡。如果人類基因能夠功能性地替代酵母的同源基因，那么將含有對(duì)應(yīng)酵母位點(diǎn) 5' 和 3' 末端同源序列的人類基因修復(fù)模板進(jìn)行共轉(zhuǎn)化，預(yù)計(jì)會(huì)得到存活的細(xì)胞。

作者首先測(cè)試了野生型 HsPSMB7 是否能夠替代 ScPUP1 在原位基因位點(diǎn)上發(fā)揮作用，但未能獲得任何存活的菌落，正如預(yù)期的那樣（圖 2a）。然而，使用具有 T44A 或 S214G 突變的 HsPSMB7 變體，修復(fù)模板允許功能性地替換酵母的 PUP1 基因（圖 2b）。此前，作者已經(jīng)證明當(dāng)酵母的 β3（PUP3）基因在質(zhì)粒上表達(dá)時(shí)，它可以被其人類同源基因（HsPSMB3）功能性地替代（Kachroo 等人，2015 年）。使用基于 HDR 的 CRISPR-Cas9 策略（阿赫梅托夫等人，2018 年），作者成功地用人類的 β3（HsPSMB3）基因替換了解析型酵母的 β3 基因（圖 2c）。因此，酵母的 β2 亞基能夠?qū)⑷祟惖?β3 亞基招募至酵母蛋白酶體核心部位，但人類的 β2c 亞基卻無(wú)法與酵母的 β3 亞基共同發(fā)揮這一作用。首先使用了人化的 β3 酵母菌株，基于 CRISPR-Cas9 的基因編輯技術(shù)現(xiàn)在能夠?qū)⒔湍钢械?β2 替換為野生型的人類 β2c（HsPSMB7）基因。雙人化的 Hsβ2c-Hsβ3 酵母菌株是可存活的，這一點(diǎn)通過(guò)位點(diǎn)特異性 PCR 和桑格測(cè)序得到了驗(yàn)證（圖 2d）。

因此，通過(guò)提供其相鄰的人類亞基，即人類 β3，通常不互補(bǔ)的人類 β2c 現(xiàn)在能夠在酵母蛋白酶體中發(fā)揮作用。然而，在酵母中提供人類 β3 并不能使酵母 β2 通過(guò) Hsβ2i 獲得互補(bǔ)。定量生長(zhǎng)測(cè)定顯示了工程菌株的適度適應(yīng)性缺陷。人化的 Hsβ2c-S214G 菌株在 23°C 時(shí)表現(xiàn)出低溫敏感的生長(zhǎng)缺陷，而人化的 Hsβ2c-T44A 菌株在 23°C 和 37°C 時(shí)的生長(zhǎng)速度比野生型菌株慢。此外，雖然人化的 Hsβ3 菌株與野生型酵母生長(zhǎng)情況相當(dāng)，但人化的 Hsβ2c-Hsβ3 菌株在 23°C 時(shí)表現(xiàn)出低溫敏感的表型，并且在液體培養(yǎng)中在 30°C 時(shí)生長(zhǎng)速度較慢。