細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序化的死亡過(guò)程，精準(zhǔn)檢測(cè)凋亡水平是細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域的核心實(shí)驗(yàn)手段。目前細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)的常用方法主要圍繞凋亡不同階段的特征(細(xì)胞膜外翻、DNA 斷裂、Caspase 活化等)設(shè)計(jì)，以下是各類方法的原理、操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)。
 

　　一、 Annexin V-FITC/PI 雙染法(檢測(cè)早期凋亡)
 

　　1. 實(shí)驗(yàn)原理
 

　　凋亡早期細(xì)胞的磷脂酰絲氨酸(PS)會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻至外側(cè)，Annexin V 可與 PS 特異性結(jié)合；碘化丙啶(PI)無(wú)法穿透活細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，僅能對(duì)凋亡晚期或壞死細(xì)胞的細(xì)胞核染色。通過(guò)雙染可區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡 / 壞死細(xì)胞。
 

　　2. 核心操作要點(diǎn)
 

　　樣本制備
 

　　貼壁細(xì)胞：用不含 EDTA 的胰酶消化，避免 EDTA 破壞細(xì)胞膜；離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 次，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1×10?~1×10? 個(gè) /mL。
 

　　懸浮細(xì)胞：直接離心收集，洗滌后調(diào)整濃度，避免細(xì)胞聚集。
 

　　染色步驟
 

　　加入 500 μL 配套的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，不可用 PBS 替代，防止?jié)B透壓失衡影響 Annexin V 結(jié)合。
 

　　依次加入 Annexin V-FITC 和 PI 染液，輕輕混勻，室溫避光孵育 10~15 min。
 

　　孵育完成后 1 h 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，避免 PI 滲透進(jìn)正常細(xì)胞導(dǎo)致結(jié)果偏差。
 

　　結(jié)果判定
 

　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)：Annexin V?/PI? 為活細(xì)胞；Annexin V?/PI? 為早期凋亡細(xì)胞；Annexin V?/PI? 為晚期凋亡 / 壞死細(xì)胞。
 

　　3. 注意事項(xiàng)
 

　　全程避光操作，防止熒光淬滅；
 

　　胰酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，避免細(xì)胞損傷引發(fā)假陽(yáng)性。
 

　　二、 TUNEL 法(檢測(cè)晚期凋亡，DNA 斷裂)
 

　　1. 實(shí)驗(yàn)原理
 

　　凋亡晚期細(xì)胞的染色體 DNA 會(huì)發(fā)生斷裂，產(chǎn)生大量 3'-OH 末端。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)可將熒光素或生物素標(biāo)記的 dUTP 連接到 DNA 末端，通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)，判斷凋亡水平。
 

　　2. 核心操作要點(diǎn)
 

　　樣本預(yù)處理
 

　　細(xì)胞爬片：用 4% 多聚甲醛固定 30 min，0.1% Triton X-100 通透處理 2~5 min，過(guò)度通透會(huì)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不足則試劑無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核。
 

　　組織切片：需進(jìn)行脫蠟、水化處理，確保試劑穿透組織。
 

　　孵育與顯色
 

　　滴加 TUNEL 反應(yīng)液(含 TdT 酶和標(biāo)記 dUTP)，37℃ 避光孵育 60 min，孵育溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶失活。
 

　　用 PBS 洗滌 3 次，每次 5 min，洗去未結(jié)合的標(biāo)記物。
 

　　熒光法直接在熒光顯微鏡下觀察；顯色法需加入 DAB 底物液，室溫顯色 5~10 min 后鏡檢。
 

　　對(duì)照設(shè)置
 

　　陽(yáng)性對(duì)照：用 DNase I 處理樣本，誘導(dǎo) DNA 斷裂；
 

　　陰性對(duì)照：用 PBS 替代 TdT 酶，排除非特異性結(jié)合。
 

　　3. 注意事項(xiàng)
 

　　反應(yīng)液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免 TdT 酶活性下降；
 

　　組織切片的通透程度需根據(jù)組織類型調(diào)整，致密組織可適當(dāng)延長(zhǎng)通透時(shí)間。
 

　　三、 Caspase 活性檢測(cè)法(檢測(cè)凋亡核心通路)
 

　　1. 實(shí)驗(yàn)原理
 

　　Caspase 家族是凋亡執(zhí)行的關(guān)鍵蛋白酶，其中 Caspase-3 是核心執(zhí)行者。該方法利用 Caspase 特異性底物(如 DEVD-AMC)，底物被活化的 Caspase 切割后會(huì)釋放熒光基團(tuán)，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度反映 Caspase 活性，間接表征凋亡水平。
 

　　2. 核心操作要點(diǎn)
 

　　細(xì)胞裂解
 

　　收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的裂解液，冰上裂解 15~30 min，期間反復(fù)吹打使細(xì)胞充分裂解。
 

　　4℃ 下 12000 rpm 離心 10 min，取上清液，避免細(xì)胞碎片干擾檢測(cè)。
 

　　酶促反應(yīng)與檢測(cè)
 

　　按比例混合上清液、底物溶液和反應(yīng)緩沖液，37℃ 孵育 1~2 h。
 

　　用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng) 380 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 460 nm)，熒光強(qiáng)度越高，代表 Caspase 活性越強(qiáng)，凋亡水平越高。
 

　　特異性驗(yàn)證
 

　　加入 Caspase 特異性抑制劑，若熒光強(qiáng)度顯著下降，說(shuō)明檢測(cè)信號(hào)來(lái)自目標(biāo) Caspase 的活化。
 

　　3. 注意事項(xiàng)
 

　　裂解液需新鮮配制，避免蛋白酶抑制劑失效；
 

　　孵育時(shí)間需嚴(yán)格控制，防止底物耗盡導(dǎo)致信號(hào)飽和。
 

　　四、 實(shí)驗(yàn)方法選擇原則
 

　　檢測(cè)早期凋亡優(yōu)先選 Annexin V-FITC/PI 雙染法；
 

　　研究凋亡晚期的 DNA 損傷或組織樣本的凋亡定位，選 TUNEL 法；
 

　　探究凋亡通路的分子機(jī)制，需結(jié)合 Caspase 活性檢測(cè)法；
 

　　為提高實(shí)驗(yàn)可信度，可采用兩種及以上方法聯(lián)合檢測(cè)。