法國LABERCA 化學(xué)實驗室 
2瑞士洛桑雀巢公司，雀巢研究中心 
3 英國曼徹斯特沃特世公司 

應(yīng)用優(yōu)勢 
牛注射了重組牛生長激素，過幾天后檢測藥物在牛體內(nèi)的殘留。得到了明確的檢測結(jié)果，可用于此類藥物的使用監(jiān)控。 
■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測生物基質(zhì)中的重組牛生長激素（rbST ），符合2002/657/EC 要求。 
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測動物血液中痕量的殘留激素藥物。 
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對于藥物監(jiān)控計劃實施中的常規(guī)分析來說是十分重要的。 

沃特世解決方案 
■ ACQUITY UPLC，Xevo TQ MS 
關(guān)鍵詞 
■ rbST，reST ，生長激素，食品安全 

簡介 
動物性食品安全控制是政府、法規(guī)機(jī)構(gòu)與組織的重要任務(wù)，應(yīng)該在食品進(jìn)入消費(fèi)環(huán)節(jié)之前就對食品安全進(jìn)行有效的檢測和控制。因為上市后的食品安全事件可能影響消費(fèi)者信心與貿(mào)易。 
重組牛生長激素（rbST ），又稱為生長激素，在一些國家通常作為豬或牛的生長促進(jìn)劑，將其用于乳?？梢栽黾优Ｄ坍a(chǎn)量1,2 。然而，生長激素的使用有嚴(yán)格的法律規(guī)范，在歐盟國家是*禁用的3,4 。但是，這項法規(guī)的執(zhí)行面臨著很大的困難，主要是因為缺乏有效的分析工具來檢測是否存在濫用該激素的情況。此分析的困難在于生長激素本身是蛋白質(zhì)，且在生物基質(zhì)中濃度較低，而樣品基質(zhì)組成又十分復(fù)雜。至今為止，分析方法僅僅局限為酶聯(lián)免疫檢測，這個方法不能將天然存在的激素與重組激素分離開來；盡管也有其它應(yīng)用報導(dǎo)，但都不能專屬性很強(qiáng)地檢測生理水平的重組牛生長激素（rbST）5,6 。 
直到zui近才開發(fā)出了一項直接檢測生物基質(zhì)中重組牛生長激素（rbST ）的方法7,8 ，這個方法是將重組生長激素用胰蛋白酶進(jìn)行水解，然后分析生長激素專有的N-端肽鏈。事實上，天然激素的N-端氨基酸是丙氨酸，而重組激素的N-端氨基酸是甲硫氨酸。 
此應(yīng)用文章展示了使用Waters® XevoTM TQ MS 分析注射了重組激素的動物血漿樣品中的藥物。在注射后幾天進(jìn)行檢測，可清晰檢測出結(jié)果，展示了*水平。 

實驗部分 
重組激素標(biāo)準(zhǔn)品 
重組牛生長激素（rbST ）標(biāo)準(zhǔn)品與重組馬生長激素（reST ）分別購自哈勃UCLA 醫(yī)學(xué)中心國家激素與垂體項目（美國托蘭斯）以及Bresagen 有限公司（澳大利亞T hebarton ）。 

樣本制備 
重組牛生長激素在血漿中的樣本提取、純化步驟依照文獻(xiàn)進(jìn)行。7,8 

MS條件 
MS系統(tǒng)：XEVO TQ MS 
離子化模式：ESI+ 
毛細(xì)管電壓：3 kV 
源溫度：150℃ 
脫溶劑溫度：550℃ 
脫溶劑氣速：800 L/小時 
碰撞氣流速：0.15 mL/分 

MRM方法參數(shù) 
MRM通道通過Masslynx軟件中的InliStartTM行獨(dú)立的參數(shù)優(yōu)化，詳見表2。 

結(jié)果與討論 
LC/MS/MS條件優(yōu)化 
ACQUITY UPLC系統(tǒng)對胰蛋白酶水解的N-端肽片段又很好的保留和分離效果，總運(yùn)行時間8分鐘，重組牛生長激素（rbST ）與重組馬生長激素（reST ）的N-端保留時間分別為2.74和2.79分鐘（圖1）。 
重組牛生長激素（rbST）N-端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生雙電荷的離子[M+2H]2+=913 ，將此離子作為母離子。根據(jù)2002/657/EC歐盟委員會決議10 ，MRM方法中選擇了兩個子離子用于確證；重組馬生長激素（reST ）作內(nèi)標(biāo)物，在樣品中的濃度為100 ng/mL ，其N-端肽鏈在電噴霧正離子模式產(chǎn)生三價電荷的離子[M+3H]3+= 623 ，將其作為母離子。 

動物注射生長激素后體內(nèi)rbST的檢測 
此方法用于檢測注射生長激素后的動物樣品。對奶牛一次性皮下注射500mg Lactatropin®藥物，然后取樣分析。 

圖1 對10 ng/mL的rbST和reST標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣，UPLC(ESI+)/MS/MS 的MRM特征離子信號分別為rbST 的N-端碎片離子為913>774和913>1047；reST的N-端碎片離子為623 >795和623 >530 



圖2 使用UPLC（ESI+）/MS/MS分析注射藥物前（D0）與注射后兩天（D2）采集到的血漿樣本的的MRM特征離子信號圖譜 

圖2顯示了注射藥物前采集到的血漿樣本得到的譜圖（D0）以及注射藥物兩天后血漿樣本的譜圖（D2）。
圖2的結(jié)果表明：可以在給動物注射生長激素兩天后在奶牛的血漿中檢測到rbST 。對采集到的特征信號分析表明此方法可以對生長激素這個蛋白進(jìn)行明確的確證，符合2002/657/EC 的要求，同時確認(rèn)了檢測方法的靈敏度。 
與預(yù)計的動物血漿蛋白水平一致?；|(zhì)干擾幾乎檢測不到，在實際血漿樣本中的良好線性可保證對rbST 的進(jìn)一步相對定量結(jié)果，在注射生長激素兩天后還可以檢測到血漿中50 ppb 的藥物，與以往實驗結(jié)果一致7,11 。表3顯示了平行進(jìn)樣10 次得到的分析結(jié)果，這充分說明Xevo TQ MS 在檢測低含量復(fù)雜樣品時能夠提供重復(fù)性好的數(shù)據(jù)。 

結(jié)論 
■ Xevo TQ MS 的高靈敏度可準(zhǔn)確檢測生物基質(zhì)中的重組牛生長激素（rbST ），符合2002/657/EC 要求
■ 方法的靈敏度高，非常適合用于在給藥幾天后檢測動物血液中痕量的殘留激素藥物 
■ Xevo TQ MS 提供重復(fù)性好的結(jié)果，且基質(zhì)效應(yīng)很低，這對于藥物監(jiān)控計劃實施中的常規(guī)分析來說是十分重要的