PriCells: 正常人原代角膜間質(zhì)細(xì)胞的分離      

實(shí)驗(yàn)材料：
1. 完整的人角膜；
2. GMF-Saline G；
3. 中性蛋白酶Ⅱ；PriCellls原代細(xì)胞分離試劑盒
4. L型膠原酶，1mg/ml在DMEM/F12/GASP中；
5. GMF-Saline G配制的TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶；
6. DMEM/F12/GASP；
7. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS；
8. CMF/GASP；
9. 3.5cm塑料組織培養(yǎng)皿或6孔板；
10. 手術(shù)刀或單刃的安全刀片；
11. 細(xì)胞濾網(wǎng)，70μm血液尼龍過濾網(wǎng)；
12. 塑料刮片，“Cell Lifter"或“Cell Scraper"；
13. 彎虹膜剪，11cm（4-3/8in）；
14. Jeweler’s鑷，10cm（4in）；
15. 角膜剪，19mm刀刃，尖頭；
16. Colibri縫紉鉗，0.1mm；
17. SDS樣本緩沖液，使用終濃度：0.058mol/L Tris，5%丙三醇，1.67% SDS，0.02%溴酚藍(lán)；
18. PriCells原代細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
19. PriCells原代細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；

實(shí)驗(yàn)方法：
1. 用GMF-Saline G清洗角膜3×5min；
2. 剪除殘留的鞏膜，結(jié)膜和虹膜；
3. 加入PriCells原代細(xì)胞分離試劑盒的試劑，4℃搖床搖動(dòng)過夜；
4. 將加入試劑的角膜4℃搖30min；
5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜；
6. 解剖顯微鏡下，小心去除上皮和內(nèi)皮細(xì)胞；
7. 用塑料刮片輕刮基膜的上皮細(xì)胞面和內(nèi)皮細(xì)胞面。顯微鏡下觀察，以確保*去除這些細(xì)胞層；
8. 用新鮮培養(yǎng)基清洗角膜基質(zhì)一次；
9. 用手術(shù)刀或安全刀片或精細(xì)手術(shù)剪將基質(zhì)剪碎成2mm左右的小塊；
10. 用DMEM/F12/2FB/GASP配制的膠原酶37℃消化3h，直至大多數(shù)組織消失；
11. 400g離心10min，棄上清；
12. 用DMEM/F12/2FB/GASP重懸細(xì)胞，用70μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾消化液，并離心；
13. 重復(fù)上述清洗步驟2遍，每遍之后細(xì)胞計(jì)數(shù)；
14. 用MJM將分離出的間質(zhì)細(xì)胞重懸并以1×10⁴/cm²的密度接種至塑料組織培養(yǎng)皿；
15. 每三天更換一次PriCells原代細(xì)胞特制基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋PriCells原代細(xì)胞培養(yǎng)特制添加劑；
16. 當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%匯合時(shí)用胰蛋白酶消化傳代：