U251MG/TMZ人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細胞

細胞介紹

通過外植技術衍生自惡性膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤。

細胞特性

1） 來源：U251膠質(zhì)瘤耐藥篩選

2） 形態(tài)：貼壁細胞

3） 含量：>1×106  細胞數(shù)

4） 用途：僅供科研使用。

U251MG/TMZ人類星形膠質(zhì)瘤耐替莫唑胺細胞

細胞運輸、保存及注意事項

細胞耐藥誘導過程

待細胞生長穩(wěn)定后，開始倍增藥物誘導劑量，每個劑量保持至細胞可以穩(wěn)定生長至匯合度達50%以上。遞增藥物濃度依次為：0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL。約8個月后，細胞可在16μg/mL TMZ藥物濃度下穩(wěn)定生長，視為耐藥細胞株構建成功，并命名為U251 MG/TMZ。

細胞培養(yǎng)試劑的配制

1）TMZ藥物的配制及保存

建議將TMZ藥物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ藥物，使其*溶解。

注意：可根據(jù)用量配置藥物，并將藥物分裝保存，避免反復凍融導致藥物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1個月，-80℃保存6個月。

2）凍存液的配制

90%優(yōu)質(zhì)胎牛血清+10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3）*培養(yǎng)基的配制（推薦使用h229-001b）

細胞培養(yǎng)條件

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%；溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%~80%。

細胞處理

1）凍存細胞的復蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4~6mL*培養(yǎng)基的離心管中混合均勻，1000rpm/min離心3~5min，棄去上清液。加入1mL*培養(yǎng)基重懸細胞后，均勻鋪于含6~8mL*培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：①細胞復蘇過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞*貼壁，形態(tài)*展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的*培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度；

②建議復蘇細胞時始終穿戴防護手套和面罩，避免凍存管因溫差較大而發(fā)生爆炸，造成人員傷害。

2）細胞傳代（建議以同等底面積的培養(yǎng)瓶/皿按照1：2比例傳代）

①待細胞密度達到80%~90%時，即可進行傳代培養(yǎng)。

②棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1次，吸凈殘余的PBS。

③加入適當體積的0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶-1mL，其它培養(yǎng)器皿可覆蓋培養(yǎng)底面即可），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2~5min，顯微鏡下觀察細胞細胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶使細胞全部脫落。迅速拿回操作臺，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化。 

④將細胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液。

⑤向細胞沉淀中加入1~2mL*培養(yǎng)基重懸細胞，輕吹混勻。將細胞懸液按1：1的比例均勻鋪于2個新的培養(yǎng)瓶/皿中，添加6~8mL*培養(yǎng)基，置于37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況，2~3day換液。

注意：細胞傳代過程中，不可使用含有藥物的培養(yǎng)基。須在細胞*貼壁，形態(tài)*展開，生長狀態(tài)穩(wěn)定后，方可根據(jù)實驗需要添加TMZ藥物。若加藥后細胞生長狀態(tài)較為緩慢，可適當降低TMZ的濃度，或使用不含TMZ的*培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞生長狀態(tài)較好時，再更換為所需的TMZ濃度。

3）細胞凍存

①細胞凍存時，步驟同2）細胞傳代的①~④，細胞計數(shù)后，加入配制好的細胞凍存液，重懸細胞，按照1×106 ~ 1×107個細胞/mL分配到一個凍存管中，標注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

②將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

1.收到細胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2.收到細胞先不開瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養(yǎng)箱靜置2-4小時（視細胞密度而定）穩(wěn)定細胞狀態(tài)。接著在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收細胞時就整體外觀拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀察記錄細胞在運輸過程中是否有污染情況。作為我方進行銷售依據(jù)。

3.由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸?shù)榷喾矫嬉蛩赜绊?，故本公司只保證客戶收到細胞后一周內(nèi)的細胞狀態(tài)，故客戶需要售后時需出示收到細胞的時間證明及客戶提供收貨時間和發(fā)現(xiàn)問題后客服人員溝通的時間證明，期間間隔時間不能大于7天。

4.所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內(nèi)操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。