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前沿丨高通量質(zhì)譜 RapidFire 助力甲醛生物轉(zhuǎn)化，加速一碳生物制造
在“雙碳”目標(biāo)與可持續(xù)制造需求的推動(dòng)下，一碳（C1）分子（如甲醛、CO?、甲醇）的生物轉(zhuǎn)化成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)——它既能減少碳排放，又能將廉價(jià)碳源轉(zhuǎn)化為乙醇醛（GALD）、二羥基丙酮（DHA）等高附加值平臺(tái)化學(xué)品，為醫(yī)藥、材料等行業(yè)提供綠色原料。
一碳生物制造的工業(yè)化進(jìn)程長(zhǎng)期受限于關(guān)鍵酶（如乙醛酸合酶 GALS）催化效率低、缺乏高效篩選方法等瓶頸。近期，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院司同教授團(tuán)隊(duì)在 ACS Synthetic Biology 發(fā)表的研究論文“Mass spectrometric screening for improving enzymatic conversion of formaldehyde into C2 and C3 products”[1]，創(chuàng)新性地將安捷倫 RapidFire 高通量液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)與酶工程、自動(dòng)化平臺(tái)結(jié)合，構(gòu)建了一套“快速篩選-高效改造”的整合方案，成功突破了甲醛酶促轉(zhuǎn)化的篩選瓶頸，為一碳生物制造的酶工程改造提供了全新范式。
專家解讀：
一碳生物制造的“酶”瓶頸與技術(shù)破局
司同教授團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期聚焦合成生物學(xué)與酶工程領(lǐng)域，尤其在一碳代謝途徑改造、高通量篩選技術(shù)開發(fā)方面成果顯著。此次研究針對(duì)一碳生物制造的核心痛點(diǎn)展開：
“甲醛作為高活性 C1 中間物，可在 GALS 催化下縮合生成 C2（GALD）、C3（DHA）產(chǎn)物，但天然 GALS 催化效率低，且傳統(tǒng)篩選方法無(wú)法滿足大規(guī)模突變體優(yōu)化需求——色譜法（HPLC/GC）定量準(zhǔn)確但每樣本需 20 分鐘，分光光度法通量高卻易受結(jié)構(gòu)相似分子干擾。”
團(tuán)隊(duì)指出，解決這一問題的關(guān)鍵在于構(gòu)建“優(yōu)化宿主-高通量檢測(cè)-突變體篩選”的閉環(huán)體系：既要通過(guò)基因編輯減少宿主代謝干擾，更要開發(fā)兼具“高選擇性、高速度、準(zhǔn)確定量”的檢測(cè)技術(shù)。而安捷倫 RapidFire 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的引入，恰好為高通量篩選提供了核心工具支撐。
研究挑戰(zhàn)：
從“底物浪費(fèi)”到“篩選低效”多重困境
在正式開展 GALS 改造前，團(tuán)隊(duì)面臨三大核心挑戰(zhàn)，這些也是一碳生物制造領(lǐng)域的共性難題：
宿主內(nèi)源代“搶底物”，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率低
大腸桿菌作為常用的微生物底盤，其內(nèi)源基因（如 frmA、dhaK）會(huì)將甲醛（FALD）轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物甲酸（FA），導(dǎo)致底物浪費(fèi)——野生型菌株中 FA 積累量高，GALD 產(chǎn)量?jī)H 97.6mg/L，且 DHA 因與 FA 色譜峰重疊，難以準(zhǔn)確定量。
傳統(tǒng)篩選方法“兩難全”，無(wú)法支撐酶改造
色譜法（HPLC）：雖能準(zhǔn)確區(qū)分 GALD、DHA 與 FA，但單次分析需 20 分鐘，若要篩選上百個(gè) GALS 突變體，耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)數(shù)天，效率極低；
分光光度法：雖能實(shí)現(xiàn) 96 孔板高通量檢測(cè)，但 GALD、DHA 的檢測(cè)依賴不同顯色反應(yīng)，且甲醛殘留會(huì)導(dǎo)致 DHA 檢測(cè)干擾率高達(dá) 48.5%，定量準(zhǔn)確性差。
GALS 突變體“大海撈針”，需兼顧通量與準(zhǔn)確性
GALS 的催化活性與 7 個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基（Ser26、Gly109 等）密切相關(guān)，要實(shí)現(xiàn)酶活性提升，需構(gòu)建覆蓋這些位點(diǎn)的飽和突變庫(kù)（約 133 種突變體）。傳統(tǒng)方法要么“慢得無(wú)法篩選”，要么“不準(zhǔn)得篩錯(cuò)方向”，難以高效找到優(yōu)勢(shì)突變體。
RapidFire 技術(shù)：
10 秒/樣本！高通量液質(zhì)聯(lián)用破解篩選困局
圖1. 安捷倫 RapidFire 400 高通量液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)
為突破上述瓶頸，團(tuán)隊(duì)將安捷倫 RapidFire 400 高通量液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)作為核心檢測(cè)工具，結(jié)合化學(xué)衍生、自動(dòng)化平臺(tái)，打造了一套針對(duì) GALS 突變體的高通量篩選方案（圖 2），從“速度、選擇性、準(zhǔn)確性”三個(gè)維度解決傳統(tǒng)方法的痛點(diǎn)：
化學(xué)衍生+MRM 模式：消除干擾，準(zhǔn)確定量
針對(duì) GALD、DHA 分子量小（易受基質(zhì)干擾）的問題，團(tuán)隊(duì)采用 10mM MBTH（3-甲基-2-苯并噻唑腙鹽酸鹽）對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理——MBTH 可與 GALD、DHA 特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的衍生物（GALD-MBTH：m/z 222→177；DHA-MBTH：m/z 252→177）。
通過(guò)安捷倫 6470 三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，可精準(zhǔn)捕捉目標(biāo)衍生物的特征離子，徹底消除甲醛、甲酸等雜質(zhì)的干擾，定量準(zhǔn)確性與 HPLC 相當(dāng)（R²＞0.998）。
在線 SPE+自動(dòng)化：10秒/樣本，通量提升 120 倍
安捷倫 RapidFire 系統(tǒng)的在線固相萃?。⊿PE）功能是高通量的核心：系統(tǒng)可自動(dòng)完成“樣品上樣-溶劑洗滌-分析物洗脫-質(zhì)譜檢測(cè)”全流程，無(wú)需手動(dòng)前處理；同時(shí)省去傳統(tǒng) HPLC 的色譜分離步驟，將單次樣品分析時(shí)間從 HPLC 的 20 分鐘壓縮至 10 秒，通量提升 120 倍。
即使對(duì) 96 孔板的突變體樣品進(jìn)行批量分析，也能在 1 小時(shí)內(nèi)完成所有檢測(cè)，大幅縮短篩選周期。
與自動(dòng)化平臺(tái)兼容：實(shí)現(xiàn)“克隆-篩選-分析”全流程無(wú)人化
團(tuán)隊(duì)將 RapidFire 液質(zhì)系統(tǒng)與機(jī)器人生物鑄造廠（Robotic Biofoundry）對(duì)接：機(jī)器人自動(dòng)完成 GALS 突變庫(kù)構(gòu)建（PCR、吉布森組裝）、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、全細(xì)胞催化，隨后直接將上清液送入 RapidFire 系統(tǒng)檢測(cè)——整個(gè)過(guò)程無(wú)需人工干預(yù)，既避免人為誤差，又進(jìn)一步提升篩選效率。
圖2. 基于 RapidFire MS 的 GALS 突變體自動(dòng)化高通量篩選方案
高通量帶來(lái)的“雙重突破”：
從高效突變體到工業(yè)化潛力
借助 RapidFire 技術(shù)的高通量?jī)?yōu)勢(shì)，團(tuán)隊(duì)成功完成了 GALS 突變庫(kù)的篩選與改造，實(shí)現(xiàn)了“酶性能提升”與“一碳轉(zhuǎn)化效率優(yōu)化”的雙重突破：
快速篩選到“超優(yōu)”GALS 突變體
針對(duì) GALS 的 7 個(gè)關(guān)鍵殘基，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了 117 個(gè)有效突變體，通過(guò) RapidFire 系統(tǒng)快速篩選，最終獲得 2 個(gè)性能顯著提升的突變體：
G109I 突變體：生成 GALD 的催化常數(shù)（kcat）較野生型提高 3.7 倍，意味著單位時(shí)間內(nèi)可催化更多甲醛轉(zhuǎn)化為 C2 產(chǎn)物；
G109F 突變體：對(duì) DHA 的米氏常數(shù)（Km）降低 5 倍（從 351.1mM 降至 72.2mM），對(duì)底物親和力大幅提升，產(chǎn)物分布向 C3（DHA）偏移。
這些突變體的獲得，為一碳生物制造提供了高效酶元件，直接推動(dòng)甲醛轉(zhuǎn)化效率提升。
建立可推廣的“一碳酶改造”范式
更重要的是，團(tuán)隊(duì)通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬驗(yàn)證了突變機(jī)制：如 G109F 突變會(huì)縮小 GALS 活性口袋體積（減少 66.88 ų），增強(qiáng)與反應(yīng)中間體的結(jié)合穩(wěn)定性，從而偏向 DHA 生成——這一機(jī)制為其他一碳轉(zhuǎn)化酶（如甲醛裂合酶、甲醇脫氫酶）的改造提供了理論指導(dǎo)。
同時(shí)，RapidFire 系統(tǒng)的寬線性檢測(cè)范圍（GALD：1.56-250 mg/L；DHA：1.56-500 mg/L）可覆蓋不同突變體的產(chǎn)物濃度，無(wú)需頻繁稀釋樣品，進(jìn)一步保障了篩選的穩(wěn)健性。
技術(shù)啟示:
RapidFire 助力合成生物學(xué)“快迭代”
司同教授團(tuán)隊(duì)的研究不僅解決了 GALS 改造的篩選問題，更為合成生物學(xué)領(lǐng)域的高通量研究提供了重要啟示：
在一碳生物制造、天然產(chǎn)物合成、工業(yè)酶改造等領(lǐng)域，“快速篩選”是加速成果轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵——安捷倫 RapidFire 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)憑借“秒級(jí)的速度、準(zhǔn)確定量的選擇性、自動(dòng)化兼容能力”，可成為連接“突變體構(gòu)建”與“性能優(yōu)化”的核心橋梁。
未來(lái)，隨著該技術(shù)與 AI 設(shè)計(jì)、自動(dòng)化平臺(tái)的進(jìn)一步融合，有望實(shí)現(xiàn)“突變體設(shè)計(jì)-篩選-機(jī)制解析”的全流程智能化，推動(dòng)一碳生物制造、醫(yī)藥中間體合成等領(lǐng)域的工業(yè)化進(jìn)程加速落地。
參考文獻(xiàn)：
Luo Y, Fu L, Chen J, et al. Mass spectrometric screening for improving enzymatic conversion of formaldehyde into C2 and C3 products[J]. ACS Synthetic Biology, 2025, 14(10): 2718-2728.