引言：

北 京 基 爾 比 生物科技公司主營產(chǎn)品：

Kilby 多通道3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

Kilby Gravity 微超重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

動(dòng)植物/微生物等地面重力環(huán)境模擬裝置【可以定制】，

Kilby Bio類器官自重力搖床，

Kirkstall Quasi Vivo 類器官3D串聯(lián)芯片灌注培養(yǎng)系統(tǒng)

（二） 處理辦法（按“從根本到技術(shù)"順序）

2.1 細(xì)胞質(zhì)量控制

新鮮或低代數(shù)細(xì)胞：盡量使用1–3 代的原代細(xì)胞或 iPSC，避免長期傳代導(dǎo)致黏附分子表達(dá)下降。

復(fù)蘇后恢復(fù)：凍存細(xì)胞解凍后先在低粘附培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12–24?h，讓細(xì)胞恢復(fù)活力再進(jìn)行聚團(tuán)操作。

2.2 調(diào)整細(xì)胞密度

經(jīng)驗(yàn)值：對(duì)大多數(shù)上皮類細(xì)胞，單孔（96孔）每孔 2?×?10?–5?×?10??個(gè)細(xì)胞即可形成 100–200?µm 的球形聚團(tuán)。

密度梯度實(shí)驗(yàn)：先設(shè)定1?×?10?、3?×?10?、5?×?10? 三個(gè)密度，觀察聚團(tuán)形成速率，選取最適密度。

2.3 優(yōu)化培養(yǎng)基

·血清/血清替代：加入5–10?% 胎牛血清（或 B27、N2）可提供黏附因子。

·特定因子：對(duì)肝、腸、腦等組織，加入Wnt3A、Rspondin、Noggin 等信號(hào)分子可促進(jìn)細(xì)胞自組織。

·pH 與滲透壓：使用CO?平衡培養(yǎng)箱，pH 維持在 7.2–7.4，滲透壓保持在 280–300?mOsm。

2.4 選擇合適的低黏附支撐

2.5 機(jī)械條件調(diào)節(jié)

·搖床/旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)：低轉(zhuǎn)速（低剪切）可促進(jìn)細(xì)胞碰撞而不致破壞聚團(tuán)。【推薦下圖——北京基爾比自重力細(xì)胞類器官孔板培養(yǎng)搖床】

制造商北京基爾比公司——多功能自重力細(xì)胞類器官孔板培養(yǎng)搖床

·間歇性輕敲：每12?h 輕敲培養(yǎng)瓶一次，幫助細(xì)胞重新聚集。

·避免過度攪拌：過快會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞破裂，聚團(tuán)形成反而受阻。

2.6 氧/營養(yǎng)供給

·控制聚團(tuán)大小：一般不超過300?µm，以免中心缺氧。

·使用透氣微孔板或微流控系統(tǒng)：提升氧擴(kuò)散，減少核心壞死。

·定期更換培養(yǎng)基：每2–3?天輕柔更換，避免擾動(dòng)聚團(tuán)。

2.7 常見“快速檢查"清單

1.細(xì)胞活力：活細(xì)胞染色（如CalceinAM）>?90?%？

2.培養(yǎng)基：血清/因子是否在有效期內(nèi)？

3.表面處理：是否使用低黏附或已涂覆Matrigel/PEG？

4.密度：是否在推薦范圍內(nèi)？

5.機(jī)械條件：搖床轉(zhuǎn)速、離心參數(shù)是否符合實(shí)驗(yàn)方案？

（三） 示例：肝細(xì)胞類器官

1.細(xì)胞準(zhǔn)備

取2?×?10??cells/孔（96孔低黏附微孔板），使用新鮮的原代肝細(xì)胞或 iPSC衍生肝前體。

2.細(xì)胞懸浮

將細(xì)胞重懸于含5?% FBS、10?ng/mL Wnt3A、50?ng/mL Rspondin1、10?ng/mL Noggin 的肝細(xì)胞培養(yǎng)基中。

3.聚團(tuán)誘導(dǎo)

輕度離心150?g，3?min，使細(xì)胞沉入微孔底部。

放入37?°C、5?% CO?培養(yǎng)箱，靜置 24?h，細(xì)胞自行聚集形成球形。

4.培養(yǎng)與監(jiān)測

每2?天輕柔更換 1/3 培養(yǎng)基，避免擾動(dòng)聚團(tuán)。

第5–7?天觀察球徑是否在 150–250?µm 范圍；若過大，可在第 4?天進(jìn)行輕度機(jī)械切割或分割。

5.功能驗(yàn)證

檢測Albumin、Urea 產(chǎn)生；若水平低于對(duì)照，考慮補(bǔ)充肝特異因子（如 HGF）或調(diào)低培養(yǎng)密度。

（四）小貼士

4.1 孔板培養(yǎng)自重力搖床：減少細(xì)胞與培養(yǎng)容器壁的接觸時(shí)間和機(jī)會(huì)，降低細(xì)胞貼壁的概率，細(xì)胞更傾向于在培養(yǎng)液中自由懸浮并相互聚集，從而有利于球體的形成?！就扑]下圖——北京基爾比——自重力細(xì)胞類器官孔板/器官芯片培養(yǎng)搖床】

磁性懸浮：通過磁場調(diào)控細(xì)胞在培養(yǎng)液中的位置，可實(shí)現(xiàn)無接觸、快速聚集，適合對(duì)聚團(tuán)大小有嚴(yán)格要求的高通量篩選。

微流控芯片：空氣-液體界面提供持續(xù)氧氣，適合需要長時(shí)間培養(yǎng)的大型類器官。Kirkstall Quasi Vivo 類器官3D串聯(lián)芯片灌注培養(yǎng)系統(tǒng)

常規(guī)技巧：使用新鮮血清、保持培養(yǎng)基pH、避免低溫、定期檢查細(xì)胞形態(tài)，都是防止“聚團(tuán)不成"的基礎(chǔ)。

結(jié)語

細(xì)胞不聚團(tuán)往往是“細(xì)胞狀態(tài) + 環(huán)境條件 + 機(jī)械支撐" 三方面的綜合結(jié)果。通過 提升細(xì)胞活力、調(diào)節(jié)接種密度、補(bǔ)充關(guān)鍵因子、選用低黏附或微孔支撐、合理控制機(jī)械攪拌，大多數(shù)類器官培養(yǎng)體系都能實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、均一的聚團(tuán)。

若仍有困難，建議先從 細(xì)胞活力 與 培養(yǎng)基成分 兩個(gè)最基礎(chǔ)的環(huán)節(jié)排查，再逐步引入孔板重力搖床或器官芯片灌流等高級(jí)技術(shù)。祝你的類器官實(shí)驗(yàn)順利！