最大限度提高滴度的慢病毒載體生產(chǎn)可擴(kuò)展解決方案 

無(wú)論您采用貼壁系統(tǒng)還是從事懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)，病毒生產(chǎn)都會(huì)是您整體運(yùn)營(yíng)過(guò)程中價(jià)格不菲的一環(huán)。我們的目標(biāo)是最大限度提高滴度，為您的病毒生產(chǎn)提供高性價(jià)比的可擴(kuò)展解決方案。 

我們致力于助力客戶取得商業(yè)化成功，這也是我們不斷開(kāi)發(fā)新的解決方案，不斷幫助您走在細(xì)胞和基因治療的根本原因。 

賽默飛提供慢病毒載體相關(guān)產(chǎn)品，請(qǐng)?jiān)L問(wèn)獲取產(chǎn)品最新信息。 

針對(duì)懸浮培養(yǎng)慢病毒生產(chǎn)進(jìn)行了優(yōu)化 

· Gibco LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系 

· 高滴度—超過(guò)1 x 108 TU/mL （未濃縮的LVVs-GFP） 

· 可擴(kuò)展的懸浮培養(yǎng)體系—規(guī)格可從96孔深孔板擴(kuò)展到2L生物反應(yīng)器 

· 無(wú)血清—消除了動(dòng)物源成份及相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn) 

· GMP積極開(kāi)發(fā)計(jì)劃 

Gibco LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系是針對(duì)化學(xué)成分明確的無(wú)血清環(huán)境下的懸浮培養(yǎng)慢病毒生產(chǎn)進(jìn)行過(guò)優(yōu)化，包含最大限度提高生產(chǎn)所需的所有高質(zhì)量成份的系統(tǒng)。? 

為改進(jìn)慢病毒生產(chǎn)而優(yōu)化的多成份體系 

LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系可提供可擴(kuò)展、高產(chǎn)量的慢病毒載體生產(chǎn)平臺(tái)。其基于在LV-MAX生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的HEK 293來(lái)源的病毒生產(chǎn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)物。通過(guò)我們先進(jìn)的脂質(zhì)體納米微粒 轉(zhuǎn)染試劑結(jié)合新型的慢病毒特異性增強(qiáng)劑和添加劑（圖1），調(diào)控實(shí)現(xiàn)最佳的慢病毒滴滴度。所有成份協(xié)同作用，相對(duì)于傳統(tǒng)的聚乙烯亞胺(PEI)血清培養(yǎng)體系，有助于生成更優(yōu)良的功能性慢病毒微粒（圖2）。上述數(shù)據(jù)證明，相對(duì)于使用未經(jīng)優(yōu)化的系統(tǒng)，我們的完整體系在提高慢病毒載體(LVV)方面的突出積極影響（圖3）。 

圖 1.LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系實(shí)驗(yàn)方案概覽 

圖 2：采用LV-MAX體系的病毒滴度顯著提高采用我們的LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系或替代轉(zhuǎn)染試劑和細(xì)胞，在30 mL搖瓶之中生產(chǎn)慢病毒。LV293 = Gibco 病毒生產(chǎn)細(xì)胞（HEK 293來(lái)源的懸浮細(xì)胞），293F = Gibco FreeStyle 293-F細(xì)胞系，PEI = 聚乙烯亞胺。 

以更低的成本實(shí)現(xiàn)更高產(chǎn)量的慢病毒生產(chǎn) 

相對(duì)于基于PEI的系統(tǒng)，LV-MAX體系的貼壁細(xì)胞慢病毒產(chǎn)量提高近15倍，懸浮細(xì)胞慢病毒產(chǎn)量提高近10倍，且成本下降了50%以上。 

圖 3.采用LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系，慢病毒產(chǎn)量大幅提升。采用LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系的懸浮細(xì)胞慢病毒產(chǎn)量（未過(guò)濾）與采用PEI介導(dǎo)的慢病毒載體轉(zhuǎn)染方法的貼壁HEK 293T/FT 細(xì)胞和懸浮HEK293細(xì)胞慢病毒產(chǎn)量比較。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞并分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定。同時(shí)展示了帶來(lái)的成本節(jié)省情況。 

更自信地規(guī)?；瘮U(kuò)展 

LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系支持在不同的懸浮培養(yǎng)皿中進(jìn)行穩(wěn)定的慢病毒生產(chǎn)。您可以根據(jù)自己在發(fā)現(xiàn)研究早期的需要擴(kuò)大或縮小自己的規(guī)模以實(shí)現(xiàn)更高的通量，亦可在維持無(wú)血清體系高產(chǎn)量的前提下無(wú)縫、高效規(guī)模化擴(kuò)展（圖4）。無(wú)論何種規(guī)模，您均可更自信地開(kāi)展生產(chǎn)。 

圖 4.LV-MAX慢病毒生產(chǎn)體系在HEK 293來(lái)源的懸浮細(xì)胞之中的可擴(kuò)展性。采用LV-MAX 慢病毒生產(chǎn)體系，通過(guò)96孔深孔板到2 L生物反應(yīng)器，進(jìn)行不同體積的慢病毒生產(chǎn)。通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞并分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定慢病毒滴度；在不同體積規(guī)格下，觀測(cè)到了相似的滴度。 

可實(shí)現(xiàn)出色的貼壁培養(yǎng)慢病毒生產(chǎn)的先進(jìn)脂質(zhì)體納米微粒技術(shù) 

Invitrogen Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑是高效、高性價(jià)比的慢病毒生產(chǎn)工具。即便是較大或難以包裝的基因，通過(guò)這種多功能試劑亦可實(shí)現(xiàn)高病毒滴度。 

Invitrogen Lipofectamine 3000試劑 

· 高滴度—涵蓋了較大或難以包裝的基因 

· 作用溫和—減少了試劑用量，提高了細(xì)胞活力 

· 靈活—與我們現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)方案兼容 

· 性價(jià)比高—所需的輔助試劑和人力成本更少 

Lipofectamine 3000試劑、Lipofectamine 2000試劑和PEI的平行比較結(jié)果顯示，Lipofectamine 3000試劑介導(dǎo)的慢病毒生產(chǎn)產(chǎn)量相對(duì)于其他轉(zhuǎn)染試劑提高了約5–10倍（圖5）。 

圖 5.采用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行的貼壁細(xì)胞慢病毒生產(chǎn)。分別將Lipofectamine 3000試劑、Lipofectamine 2000試劑和PEI加入到含HEK 293T/FT細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板中，獲得pLenti6.3/V5-GW/EmGFP和Invitrogen ViraPower慢病毒包裝混合物。轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080細(xì)胞并分析GFP陽(yáng)性細(xì)胞，測(cè)定慢病毒滴度。 

病毒轉(zhuǎn)染原理及步驟 

對(duì)于不適合脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，通常使用病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染也稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種轉(zhuǎn)染方式可在難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型中實(shí)現(xiàn)蛋白過(guò)表達(dá)或敲低，是臨床研究中的方法（Glover 等人，2005；Pfeifer 和 Verma，2001）。腺病毒、致癌逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體已廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物和體內(nèi)的基因遞送。病毒基因轉(zhuǎn)移的其他示例包括基于桿狀病毒和牛痘病毒的載體。有關(guān)各種病毒遞送系統(tǒng)的更多信息，請(qǐng)參見(jiàn)病毒載體。 

雖然病毒能整合到宿主基因組中，體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率高且能持續(xù)基因表達(dá)，因而成為臨床試驗(yàn)中基因遞送的系統(tǒng)，但也存在許多缺點(diǎn)，包括其免疫原性和細(xì)胞毒性、載體方面存在技術(shù)挑戰(zhàn)且生產(chǎn)程序耗時(shí)費(fèi)力、生物安全要求導(dǎo)致高成本、低包裝能力（大多數(shù)病毒載體約為 10 kb，而非病毒載體約為 100 kb）以及病毒載體制劑的感染性存在變異性（Glover 等人，2005；Kim 和 Eberwine，2010；Vorburger 和 Hunt，2002） 

典型的轉(zhuǎn)導(dǎo)方案涉及改造攜帶轉(zhuǎn)基因的重組病毒、在包裝細(xì)胞系中擴(kuò)增重組病毒顆粒、純化和滴定擴(kuò)增后的病毒顆粒以及隨后感染目標(biāo)細(xì)胞。雖然在原代細(xì)胞和細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率相當(dāng)高（約為 90%-100%），但只有攜帶病毒特異性受體的細(xì)胞才能被病毒感染。同樣重要的是應(yīng)注意，用于病毒擴(kuò)增的包裝細(xì)胞系需要用非病毒轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染。 

病毒遞送操作流程 

步驟一：生成病毒 

通過(guò)基因克隆生成重組病毒。 

步驟二：非病毒轉(zhuǎn)染 

使用非病毒方法轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系以擴(kuò)增和分離病毒載體。 

步驟三：病毒純化 

純化并滴定含轉(zhuǎn)基因的病毒載體。 

步驟四：感染和病毒清除 

以適當(dāng)?shù)母腥緩?fù)數(shù) (MOI) 感染目標(biāo)細(xì)胞（含病毒特異性受體）。 

從培養(yǎng)物中去除病毒和/或加入新鮮培養(yǎng)基。 

步驟五：檢測(cè)細(xì)胞 

檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞的基因表達(dá)或沉默情況。 

如需合作轉(zhuǎn)載本文，請(qǐng)文末留言。 

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