小鼠膽管類器官是一種在體外三維培養(yǎng)體系中，由膽管上皮細(xì)胞或干細(xì)胞衍生、自我組織形成的微型結(jié)構(gòu)。該模型能模擬膽管的上皮屏障功能、分泌特性及對(duì)損傷的應(yīng)答，其成功構(gòu)建與長(zhǎng)期培養(yǎng)高度依賴于一套精確的細(xì)胞因子組合。

第一部分：關(guān)鍵生長(zhǎng)因子的核心作用

膽管類器官的體外構(gòu)建依賴于幾種關(guān)鍵生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用，這些因子為細(xì)胞的增殖與形態(tài)發(fā)生提供了基礎(chǔ)信號(hào)支持。

表皮生長(zhǎng)因子（EGF）

表皮生長(zhǎng)因子是一種高效的有絲分裂原，在膽管類器官培養(yǎng)中提供基礎(chǔ)的增殖信號(hào)。EGF通過與其受體結(jié)合，激活下游的MAPK和PI3K-Akt等信號(hào)通路，直接促進(jìn)膽管上皮細(xì)胞的持續(xù)分裂與擴(kuò)增。這種廣泛的促增殖作用為類器官的初始形成和后續(xù)傳代擴(kuò)增提供了必要的生長(zhǎng)動(dòng)力。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員（特別是FGF10）是驅(qū)動(dòng)膽管類器官形態(tài)構(gòu)建的關(guān)鍵因子。FGF信號(hào)在膽管系統(tǒng)的胚胎發(fā)育中起著核心作用，在體外培養(yǎng)中同樣指導(dǎo)著類器官的管腔形成和出芽生長(zhǎng)。它通過調(diào)控細(xì)胞的極性建立和定向遷移，促進(jìn)復(fù)雜的三維管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的生成，這對(duì)于構(gòu)建功能性的膽管模型至關(guān)重要。

第二部分：核心信號(hào)通路的精密調(diào)控

除了直接的生長(zhǎng)因子，幾條核心信號(hào)通路的精確平衡對(duì)膽管類器官的特異性分化與功能維持起著決定性作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路

Wnt信號(hào)通路是啟動(dòng)膽管類器官形成的首要開關(guān)。適度的Wnt信號(hào)激活（通常由Wnt3a配體介導(dǎo)）能夠誘導(dǎo)膽管上皮細(xì)胞的去分化和增殖，促進(jìn)類器官的初始形成。然而，該通路的活性需要被嚴(yán)格控制在特定水平，過度或持續(xù)的Wnt信號(hào)激活反而會(huì)抑制膽管特異性標(biāo)志物的表達(dá)，干擾其正常的功能成熟。

TGF-β/BMP信號(hào)通路

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)通路在膽管類器官中構(gòu)成一個(gè)精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。與小腸類器官需要強(qiáng)力抑制BMP不同，膽管類器官的培養(yǎng)需要適度保留特定的TGF-β/BMP信號(hào)活性。這些通路在誘導(dǎo)膽管特異性基因表達(dá)和建立細(xì)胞極性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，其濃度平衡至關(guān)重要，過強(qiáng)的信號(hào)會(huì)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致類器官結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失。

第三部分：小鼠膽管類器官模型構(gòu)建

小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）的制備：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞因子及各類添加物按既定比例混合，配制成培養(yǎng)基。

1、原代

（1）在超凈臺(tái)里快速剖開小鼠腹腔，取出肝組織，置于預(yù)冷PBS（加青霉素、鏈霉素、原代抗生素）中清洗。

（2）將清洗后的組織塊收集到1.5ml EP管中，使用無菌尖頭眼科手術(shù)剪將組織塊盡量剪碎(勻漿狀）。組織剪切程度與消化時(shí)間相關(guān)，剪切程度越高則消化時(shí)間越短，將剪碎后的組織轉(zhuǎn)移至15ml無菌離心管中。

（3）加10倍體積的組織消化液消化，37℃震蕩10-30min，消化過程中隨時(shí)觀察情況。當(dāng)視野中觀察到有大量細(xì)胞漏出，且大部分細(xì)胞呈細(xì)胞團(tuán)塊時(shí)，可終止消化（注：不要消化到單細(xì)胞狀態(tài)）。

（4）在確認(rèn)消化完成的組織懸液中，加入胎牛血清（FBS）至終濃度達(dá)2-5%或終濃度為0.1%的BSA后吹打混勻。

（5）將組織與細(xì)胞懸液過70µm細(xì)胞濾網(wǎng)，將過濾后的細(xì)胞懸液1000rpm，離心5min，離心后去上清。

（6）若離心后沉淀中觀察到明顯的紅色沉淀（紅細(xì)胞），加入2ml紅細(xì)胞裂解液，吹打混勻后放置3min。加10ml PBS重懸終止裂紅， 1000rpm 離心5min后，棄上清。

（7）適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基或PBS重懸沉淀。

（8）以合適的比例混合基質(zhì)膠和細(xì)胞，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，每孔點(diǎn)膠25-30ul基質(zhì)膠混合物進(jìn)行鋪板（4℃下操作）。

（9）將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中20-30min成膠，添加適量小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）進(jìn)行培養(yǎng)。

2、類器官傳代培養(yǎng)

（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃靜置20-30min，每3-5孔為一組。1000rpm離心5min棄去液體，保留沉淀。

（3）添加適量基質(zhì)膠重懸類器官，每孔25-30ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中20-30min成膠，添加適量小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）培養(yǎng)。

3、類器官凍存

（1）移液槍吸去培養(yǎng)基，每孔添加1-2ml 4℃ PBS，放置2min。

（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，PBS定容到10-14ml ，4℃靜置20-30min，每3-5孔為一組。1000rpm離心5min棄去液體，保留沉淀。

（3）添加適量類器官凍存液，輕柔吹打重懸，以24孔細(xì)胞培養(yǎng)板為例，密度為2-3個(gè)孔凍存1管，每管體積1ml。

（4）做好標(biāo)記信息，進(jìn)行程序降溫后，移入液氮長(zhǎng)期保存。

4、類器官復(fù)蘇

（1）取10ml DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基于15ml離心管中。

（2）從液氮罐中取出凍存的類器官，快速置于 37℃水浴鍋中融解。

（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動(dòng)冷凍管，以確保凍存液在 1-2min內(nèi)融解。

（4）將溶解后的類器官快速轉(zhuǎn)移至15ml 離心管，使用移液器輕輕吹打6-8次，1000rpm離心 5min，然后除去上清液并收集類器官沉淀。

（5）基質(zhì)膠重懸，每孔25-30ul基質(zhì)膠鋪在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中20-30min成膠，添加適量小鼠膽管類器官培養(yǎng)基（擴(kuò)增）。

Cholangiocyte Organoid Expansion Cytokine Set, Mouse /小鼠膽管類器官（擴(kuò)增）細(xì)胞因子套裝_UA090044_優(yōu)愛(UA BIOSCIENCE)

優(yōu)愛蛋白（UA Bio）,重組蛋白專家

優(yōu)愛蛋白專注于提供藥物研發(fā)、細(xì)胞治療、基因治療、基礎(chǔ)科研所需各種蛋白類試劑原材料和服務(wù)，包括藥物靶點(diǎn)蛋白、免疫檢查點(diǎn)蛋白、細(xì)胞因子、工具酶、 蛋白定制表達(dá)、全長(zhǎng)跨膜蛋白開發(fā)等。優(yōu)愛致力于為客戶提供優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品和專業(yè)服務(wù)，打造具有國際競(jìng)爭(zhēng)力的高新技術(shù)企業(yè)。