想象一下，在實驗室里培養(yǎng)出一個擁有完整結構的"迷你小腸"或"微型大腦"？這不是科幻！類器官——這種神奇的"迷你器官"，正讓這一切成為現(xiàn)實，為疾病研究、新藥研發(fā)打開了一扇全新的大門。
Section.01
類器官：研究背景
類器官是什么？
類器官是源自干細胞或器官祖細胞的三維細胞聚集體。它能模擬真實器官的關鍵功能和復雜結構，用來進行疾病研究或藥物測試，結果比傳統(tǒng)方法更接近體內(nèi)的真實情況[1]。
類器官培養(yǎng)的意義是什么？
類器官的開發(fā)對人體器官和組織功能的研究意義重大。這得益于這些微型器官能夠很好地展現(xiàn)人體生物學特性[2]。
小鼠小腸類器官被視為最-經(jīng)典和成熟的類器官模型之一，這一定位根植于 Hans Clevers 教授團隊 2009 年的開創(chuàng)性工作。該團隊首-次實現(xiàn)了成年小腸干細胞在體外的類器官培養(yǎng)，為此領域的蓬勃發(fā)展奠定了基礎。小鼠小腸類器官廣泛應用于基礎研究、藥物篩選、宿主-微生物互作、疾病建模等領域。與傳統(tǒng)的二維 (2D) 培養(yǎng)系統(tǒng)相比，3D 類器官培養(yǎng)提供了一個更具生理相關性的模型[3][4]。
圖 1. 已建立的小鼠小腸類器官培養(yǎng)方法[5]。
類器官技術為核心疾病建模與個體化治療提供了強大平臺。該類模型能夠高度模擬出生缺陷、癌癥、傳染病、代謝性疾病等條件下的器官發(fā)育與疾病演進過程。例如，血管類器官已被應用于揭示糖尿病血管功能障礙的相關分子通路。在藥物研發(fā)領域，類器官與器官芯片技術有望共同減少對傳統(tǒng)動物模型的依賴，廣泛應用于藥物篩選、毒理與藥理評估，最終推動個體化治療的實現(xiàn)[6][7][8]。
Section.02
小腸類器官：培養(yǎng)指南
將 Lgr5+ 腸道干細胞包埋于基質(zhì)膠中，并利用含有 WENR (Wnt3a, EGF, Noggin, R-spondin 1) 因子的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，就成功構建了腸道類器官模型。該模型不僅能實現(xiàn)干細胞的無限增殖，還再現(xiàn)了腸道上皮的細胞多樣性，從而為原位、實時觀察上皮發(fā)育與分化提供了理想平臺[9][10]。
圖 2. 從小鼠腸道隱窩生成類器官的步驟流程[9]。
實驗步驟:
1. 小鼠腸隱窩的分離
(1) 將小鼠禁食過夜或禁食 24 小時，用二氧化碳窒息法對 5 至 8 周齡小鼠實施安-樂-死，在分離小腸和結腸之前，用 70% 乙醇擦拭小鼠皮毛進行消毒。
(2) 切取約 18-20 cm 長的近端小腸段。對于結腸部分，應解剖約 3–6 cm 的腸段，切割位置宜選擇在盲腸下方數(shù)毫米及直腸上方數(shù)毫米處，以避免引入過多毒素及代謝廢物污染培養(yǎng)體系，同時考慮到近端結腸區(qū)域具有較高的干細胞密度。隨后，使用鑷子仔細清除腸段表面附著的脂肪殘留、血管及外膜組織。
(3) 將分離的腸段小心地放入一個 10 厘米的細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中應加入 10 mL 預冷 PBS，用 10 mL 毫升注射器和 21G 針頭，用預冷的 PBS 輕輕沖洗腸腔，直至所有糞便顆粒都被排出。
(4) 用剪刀縱向剪開腸段，使之形成腸片，用預冷的 PBS 輕輕沖洗腸片。
(5) 將腸段切成約 2-5 mm 的小塊，轉移到裝有 25 mL 預冷 PBS 的 50 mL 離心管中。
(6) 用血清移液管輕柔地吹打腸段小塊五次。讓樣本靜置約 20 秒，使組織碎片依靠重力自然沉降到管底。
(7) 待碎片沉降后，棄去 PBS。然后，向離心管中重新加入 25 mL 預冷 PBS，重復步驟 (6) 和 (7) 直到剩余的 PBS 變得清澈透明為止。
(8) 棄去清澈的 PBS，將組織碎片重懸于 20 mL 0.05% 的胰蛋白酶 /EDTA 溶液中。將樣本在 37 ℃、轉速為 20 rpm 的旋轉搖床上孵育 20 分鐘。
(9) 棄去胰蛋白酶 /EDTA 溶液，用 10 mL 預冷的 0.1% BSA 溶液重懸碎片。用預先潤濕的血清移液管輕柔地吹打碎片三次。
(10) 讓組織碎片自然沉降后，將樣本的上清液部分通過一個 70 μm 的細胞篩網(wǎng)過濾，收集第一部分濾液。
(11) 向剩余的組織沉淀中加入 10 mL 0.1% BSA 溶液，用預先潤濕的血清移液管輕柔地吹打碎片三次。重復步驟 (10)，收集第二部分濾液。
(12) 重復步驟 (9)(10)(11)，直至收集第五部分濾液。
(13) 將第四和第五部分濾液在 4-6 ℃、轉速為 300 g 的條件下離心 5 分鐘。棄去上清，將含有腸道隱窩的沉淀重懸于 5 mL DMEM/Nutrient Mixture F-12 培養(yǎng)基中。
(14) 取部分濾液樣本轉移到六孔板中，在倒置光學顯微鏡下觀察隱窩的質(zhì)量。
圖 3. 小鼠分離腸隱窩的樣本圖像[4]。
2. 從分離的小鼠腸隱窩中制備腸類器官
(1) 將隱窩重懸于 DMEM/Nutrient Mixture F-12 后，用預先潤濕的微量移液器吸頭吸取 10 微升樣本，滴加到細胞計數(shù)板上，計數(shù)分離物中的隱窩數(shù)量。
(2) 將隱窩分離物在 4-6 ℃、300 g 的條件下離心 5 分鐘，棄去上清。
(3) 將隱窩分離物重懸于 180 μL 的小鼠腸道類器官生長培養(yǎng)基和基質(zhì)膠的 1:1 混合液中，并使用剪口吸頭充分混勻。
(4) 用剪口微量移液器吸頭，將培養(yǎng)基-基質(zhì)膠混合液 (每滴 30 μL) 滴加到六孔板的一個孔中，形成液滴穹頂，并將隱窩分離物包埋其中。
(5) 輕輕將培養(yǎng)板翻轉，在 37 ℃、5% CO2、80% 相對濕度的 CO2 培養(yǎng)箱中孵育 30 分鐘，使基質(zhì)膠聚合。
(6) 沿孔壁緩慢加入 2 mL 小鼠腸道類器官生長培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)板放入 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(7) 每天更換培養(yǎng)基，直到類器官完-全發(fā)育成熟。
圖 4. 腸類器官的形態(tài)發(fā)展[4]。
Section.03
小腸類器官培養(yǎng)：注意事項
1. 如果使用 0.25% 胰蛋白酶 /EDTA，則必須進一步稀釋，以避免組織中的細胞損壞。
2. 與小腸相比，結腸中的腸道干細胞密度較低，因此建議使用兩個以上的結腸以提高細胞密度。
3. 小鼠腸道一定要剪的足夠碎，否則會影響隱窩的提取。
4. 血清移液器必須預先潤濕，以防止腸碎片或腸隱窩粘附在移液器壁上。建議事先用 PBS 上下移液，作為潤濕步驟。
5. 基質(zhì)膠一定要在冰上操作，室溫下很容易變稠或凝固?；|(zhì)膠與隱窩混懸時吹打也一定要輕柔，一旦混入氣泡，后期培養(yǎng)過程中很容易出現(xiàn)散膠甚至溶膠的現(xiàn)象。
6. 加培養(yǎng)基時，請勿直接滴加在基質(zhì)膠滴上，以免破壞膠滴。培養(yǎng)基在使用前也一定要恢復室溫，冷藏的培養(yǎng)基直接加入到培養(yǎng)孔中很容易破壞膠滴。
7. 為了加速 Matrigel 的完-全凝固，可以預先將培養(yǎng)板在 37℃ 的 CO2 培養(yǎng)箱中加熱。
8. 類器官構建后，類器官的表征是非常重要的，在鑒定類器官后可進行下游應用。初步可以通過顯微鏡和 H&E 染色觀察形態(tài)；然后可以用 Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術檢測該類器官是否表達相應的 biomarker；基因測序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能。
Section.04
小結
小鼠小腸類器官是一項革命性技術，通過在體外三維培養(yǎng)中模擬真實腸道結構，為疾病研究、藥物篩選及發(fā)育生物學提供了無比接近體內(nèi)環(huán)境的強大平臺。成功培養(yǎng)小鼠小腸類器官，是精密操作、優(yōu)質(zhì)基質(zhì)膠與含有核心因子培養(yǎng)基三者結合的藝術。掌握其原理并嚴格把控細節(jié)，您就能在培養(yǎng)皿中重現(xiàn)一個生機勃勃的“迷你腸道"。
產(chǎn)品推薦 |
MCE ATP 發(fā)光法 3D 細胞活力檢測試劑盒 (HY-K6017) MCE ATP 發(fā)光法 3D 細胞活力檢測試劑盒基于高靈敏度生物發(fā)光檢測技術 (熒光素酶系統(tǒng))，通過對 ATP 進行定量以測定培養(yǎng)物中 3D 細胞數(shù)目及細胞活力。 |
MCE 類器官分離液 (HY-K6015) MCE 類器官分離液是一種即用型類器官分離液，可將類器官從基質(zhì)膠中分離并回收完整的類器官，廣泛應用于基于基質(zhì)膠培養(yǎng)的類器官的分離消化過程。 |
MCE 類器官基底膜基質(zhì)膠 (HY-K6007) MCE 類器官基底膜基質(zhì)膠主要成分是小鼠腫瘤中提取的天然基底膜基質(zhì)，主要用于培養(yǎng)類器官。 |
MCE 類器官凍存液 (HY-K6014) MCE 類器官凍存液是一種即用型類器官凍存液，可廣泛應用于多種哺乳動物 (如人、鼠、豬、牛等) 來源的類器官和細胞系的凍存。 |
MCE 人小腸類器官培養(yǎng)試劑盒 (HY-K6113) MCE 人小腸類器官培養(yǎng)試劑盒包含小腸類器官基礎培養(yǎng)基 A 以及培養(yǎng)添加物 B (50x)，培養(yǎng)添加物 C (250x) 和培養(yǎng)添加 D (250x)。該產(chǎn)品可有效構建人小腸類器官。 |
[1] Madeline A Lancaster, et al. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014 Jul 18;345(6194):1247125.
[2] Hans Clevers, et al. Optimization of human small intestinal organoids. 23 August 2022.
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[6] Katia Cheaito, et al. Establishment and characterization of prostate organoids from treatment-na?ve patients with prostate cancer. Oncol Lett. 2022 Jan;23(1):6.
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