2025 年 4 月 4 日，美國(guó)加州斯克利普斯研究所的Kendall W. Nettles教授和John R. Yates III教授作為共同通訊作者在nature chemical biology雜志上發(fā)表了題為《Native top-down proteomics enables discovery in endocrine-resistant breast cancer》的文章，該文開發(fā)了一種Native top-down proteomics（nTDP） 策略，用于識(shí)別乳腺癌細(xì)胞（包括過表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的內(nèi)分泌抵抗模型）中≤70 kDa 的蛋白質(zhì)組復(fù)合物，共鑒定出17 種蛋白質(zhì)復(fù)合物的 104 種 complexoforms（蛋白質(zhì)復(fù)合物的特定組裝形式）。該研究發(fā)現(xiàn)，EGFR 可誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)因子 2（NUTF2）組裝體解離，而 NUTF2 的 K4 和 K55 翻譯后修飾位點(diǎn)對(duì)雌激素受體（ER）信號(hào)通路的抑制有差異化影響。該研究揭示了乳腺癌蛋白質(zhì)組的分子特征及 complexoforms 在腫瘤生長(zhǎng)和治療抵抗中的作用，為理解疾病機(jī)制和開發(fā)藥物提供了新視角。

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一

研究背景

世衛(wèi)組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新發(fā)病例高達(dá)226萬例，超過了肺癌的220萬例。 乳腺癌已經(jīng)取代肺癌，成為全球第一大癌癥。蛋白質(zhì)通過非共價(jià)相互作用組裝形成功能復(fù)合物，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)包括乳腺癌等惡性腫瘤相關(guān)的幾乎所有關(guān)鍵功能，而蛋白質(zhì)因差異剪接、序列變異、翻譯后修飾（PTMs）或突變產(chǎn)生的多種 proteoform 會(huì)影響這些功能復(fù)合物的形成、穩(wěn)定性和活性。傳統(tǒng)的自下而上蛋白質(zhì)組學(xué)方法在闡明單個(gè)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的 proteoform、表征與蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合的配體和輔因子以及繪制組合 PTMs 模式方面存在局限。原生質(zhì)譜（Native MS）和自上而下蛋白質(zhì)組學(xué)（Top-down Proteomics）結(jié)合形成的Native Top-down Proteomics（nTDP）雖有結(jié)構(gòu)解析能力，但因復(fù)雜生物樣本中蛋白質(zhì)復(fù)合物豐度低，蛋白質(zhì)復(fù)合物分離困難，缺乏處理大規(guī)模 nTDP 數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)工具的等問題，nTDP目前主要用于純化的蛋白質(zhì)復(fù)合物的分析中，在復(fù)雜生物樣中的應(yīng)用較少。在乳腺癌研究中，生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)是內(nèi)分泌治療抵抗的主要機(jī)制之一，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）擴(kuò)增及下游信號(hào)成分突變與臨床他莫昔芬抵抗相關(guān)，但具體機(jī)制尚未明確。因此，需要一種有效的方法來研究乳腺癌細(xì)胞中蛋白質(zhì)組裝體的特征，以深入理解疾病分子機(jī)制和設(shè)計(jì)有效藥物，這為該研究開發(fā)并應(yīng)用 nTDP 策略提供了背景和動(dòng)力。

二

研究方法

1

研究對(duì)象：

雌激素受體 α（ERα）陽性的 MCF-7 乳腺癌細(xì)胞（后續(xù)稱MCF-7細(xì)胞）和過表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的 MCF-7 細(xì)胞（作為 ER 靶向治療的耐藥模型，后續(xù)稱MCF-7-EGFR細(xì)胞）。

2

nTDP 工作流程

研究者開發(fā)的nTDP 工作流程如圖1所示，首先利用離線native尺寸排阻色譜（nSEC）將從細(xì)胞中提取可溶性蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行分離；隨后通過nano-ESI–FAIMS–MSn（液相：Easy-nLC 1200，氣相分離裝置：FAIMS，質(zhì)譜：Orbitrap Fusion Lumos ）對(duì)蛋白復(fù)合物進(jìn)行native top-down的表征分析；最后利用ProSight Native軟件結(jié)合手動(dòng)校正解析復(fù)雜質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

圖1：nTDP 工作流程（點(diǎn)擊查看大圖）

三

研究結(jié)果

1

nTDP 工作流程驗(yàn)證

研究者首先利用三個(gè)蛋白復(fù)合物：carbonic anhydrase II(CA II，~29.1 kDa)，streptavidin (SA， ~53 kDa) ，avidin (AV，~67 kDa)來驗(yàn)證該 nano-ESI–FAIMS–MSn 系統(tǒng)的重現(xiàn)性和穩(wěn)健性。結(jié)果表明該系統(tǒng)可以穩(wěn)定的分離、碎裂蛋白復(fù)合物，產(chǎn)生能有效闡明蛋白質(zhì)表征的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖2-4）。同時(shí)還驗(yàn)證了FAIMS可以在氣相水平上對(duì)高到70kDa蛋白復(fù)合物進(jìn)行分離。（圖5）

圖2：CA II 的 nTDP 譜圖及其由 ProSight Lite 生成的碎片圖（點(diǎn)擊查看大圖）

圖3：SA 的 nTDP 譜圖及其由 ProSight Lite 生成的碎片圖（點(diǎn)擊查看大圖）

圖4：AV的 nTDP 譜圖及其由 ProSight Lite 生成的碎片圖（點(diǎn)擊查看大圖）

圖5：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)復(fù)合物的基峰遷移圖及其CV值

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2

nTDP 分析MCF-7 和 

MCF-7–EGFR 細(xì)胞提取物

隨后研究者用nSEC系統(tǒng)對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF-7和MCF-7-EGFR）的細(xì)胞提取物進(jìn)行分離，nSEC譜結(jié)果表明從MCF-7 和 MCF-7–EGFR （16次重復(fù)實(shí)驗(yàn)）提取的蛋白復(fù)合物均能穩(wěn)定有效的分離。將分離的蛋白復(fù)合物用nano-ESI–FAIMS–MSn 系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，共測(cè)出17 種蛋白質(zhì)復(fù)合物的104 種 complexoforms，包括蛋白質(zhì) - 金屬?gòu)?fù)合物、蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì) - 金屬?gòu)?fù)合物及蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)復(fù)合物。

圖6：MCF-7中的蛋白質(zhì)標(biāo)品和蛋白質(zhì)聚集體的nSEC譜圖、MCF-7細(xì)胞中蛋白質(zhì)聚集體膠圖、MCF-7-EGFR中的蛋白質(zhì)標(biāo)品和蛋白質(zhì)聚集體的nSEC譜圖、MCF-7-EGFR細(xì)胞中蛋白質(zhì)聚集體膠圖。（點(diǎn)擊查看大圖）

3

與乳腺癌相關(guān)的蛋白質(zhì)復(fù)合物表征分析

• TPI  complexoforms：TPI是一種與乳腺癌相關(guān)的糖酵解酶，有研究表明TPI可能與藥物耐藥、腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究者在MCF-7和MCF-7–EGFR細(xì)胞中均觀察到TPI二聚體結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量約為53 kDa（nSEC-fraction4）。二聚體 TPI 復(fù)合物是由截短和磷酸化的單體蛋白質(zhì)變體組合形成，單體蛋白質(zhì)變體上發(fā)生兩個(gè)脫酰胺（N15 和 N71）。研究者還發(fā)現(xiàn)了由突變（E104D）TPI單體形成的TPI復(fù)合物，并且E104D單體亞基的TPI可以被磷酸化、去酰胺化或乙?；?/span>

圖7： MCF-7細(xì)胞提取物中TPI complexoforms復(fù)合物的nTDP譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）

• MIF complexoforms：MIF是在多種癌癥、自身免疫疾病和炎癥中具有生物學(xué)相關(guān)性的多功能細(xì)胞因子，研究者發(fā)現(xiàn)MIF在 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 細(xì)胞中均高表達(dá)，native MS1 譜圖提供了MIF complexoforms的詳細(xì)信息，一共形成了五種 MIF（同源和異源）三聚體結(jié)構(gòu)。通過MSn的譜圖解析發(fā)現(xiàn)了截短的、未修飾的、亞硝基化和乙酰化的MIF單體蛋白質(zhì)變體（亞硝基化和乙?；謩e發(fā)生在C80和K77上）。

圖8： MCF-7細(xì)胞提取物中MIF complexoforms復(fù)合物的nTDP譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）

• SOD1 complexoforms：金屬酶SOD1是一種重要的抗氧化劑，對(duì)于癌基因驅(qū)動(dòng)的乳腺腫瘤形成以及超氧化物轉(zhuǎn)化為O2和H2O2至關(guān)重要。研究者在 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 細(xì)胞中觀察到分子質(zhì)量約為 32 kDa 的 SOD1 二聚體結(jié)構(gòu)，從MS1譜圖（11 + 電荷狀態(tài)）和MS2譜圖（6 + 電荷狀態(tài)）中均觀察到SOD1蛋白質(zhì)變體亞基中Cu2+ 和 Zn2+金屬離子的非共價(jià)結(jié)合，SOD1 蛋白質(zhì)變體還帶有 N 端乙?；⒁粚?duì)二硫鍵（C57-C111）和N-端甲硫氨酸的切除。

圖9： MCF-7細(xì)胞提取物中SOD1 complexoforms復(fù)合物的nTDP譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）

• NUTF2 complexoforms：NUTF2是一種二聚體蛋白，介導(dǎo)小GTP酶Ran的核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。研究者從 MCF-7 和 MCF-7-EGFR 細(xì)胞中共鑒定出8 種不同 PTM 組合的NUTF2 蛋白質(zhì)變體，且這些單體在26 種不同的complexoforms中分布。從MS1譜圖中發(fā)現(xiàn)，與 MCF-7 細(xì)胞相比，MCF-7-EGFR 中內(nèi)源性 NUTF2 二聚體復(fù)合物含量顯著減少，且具有三個(gè)乙?；?NUTF2 異二聚體是 MCF-7-EGFR 細(xì)胞特有的。

圖10： MCF-7和MCF-7–EGFR細(xì)胞提取物中NUTF2的nTDP譜圖（點(diǎn)擊查看大圖）

圖11：MCF-7和MCF-7–EGFR細(xì)胞提取物中NUTF2 complexoforms 和proteoforms 的強(qiáng)度信息（點(diǎn)擊查看大圖）

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4

NUTF2介導(dǎo)EGFR和ER通路之間的相互作用

前期nTDP數(shù)據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCF-7-EGFR細(xì)胞中NUTF2 二聚體的數(shù)量顯著比MCF-7細(xì)胞中低，研究者利用NUTF2 與兩種不同的親和標(biāo)簽共同沉淀，驗(yàn)證 了EGFR 可誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)因子 2（NUTF2）二聚體解離這一結(jié)論。NUTF2 的翻譯后修飾（PTM）位點(diǎn)在脊椎動(dòng)物中具有保守性，NUTF2蛋白復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)表明，K4靠近核孔蛋白結(jié)合位點(diǎn)。K55和K63靠近Ran結(jié)合位點(diǎn)，其中K55參與Ran與NUTF2之間的水介導(dǎo)接觸，因此研究者對(duì)K4和K55位點(diǎn)進(jìn)行了突變。結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞中NUTF2 的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)， K4Q 突變可逆轉(zhuǎn)該抑制，K55R 突變則增強(qiáng)抑制，這表明 PTM 位點(diǎn)（K4、K55）可通過影響核孔結(jié)合或 Ran 相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)。NUTF2下調(diào)了雌激素誘導(dǎo)的增殖基因GREB1，而K4Q突變可在沒有4OHT的情況下恢復(fù)了這一表型。這表明不同 PTM 位點(diǎn)的 NUTF2 proteoforms 會(huì)導(dǎo)致不同的生物學(xué)結(jié)果。

圖12 ：NUTF2 調(diào)節(jié)ER的信號(hào)傳導(dǎo)并抑制生長(zhǎng)

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為了進(jìn)一步研究 NUTF2 如何調(diào)節(jié) ER 信號(hào)傳導(dǎo)和對(duì) 4OHT 的響應(yīng)，通過 CUT&RUN 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，MCF-7 細(xì)胞中 ER 與 NUTF2 的結(jié)合位點(diǎn)基本不重疊，但 NUTF2 表達(dá)和 4OHT 處理會(huì)改變 ER 的結(jié)合模式。NUTF2 表達(dá)會(huì)導(dǎo)致 ER 在 1353 個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合存在差異，且 4OHT 處理后 MCF-7 與 MCF-7NUTF2 細(xì)胞的 ER 結(jié)合位點(diǎn)既有重疊也有差異。但在 4OHT 敏感的 NUTF2 位點(diǎn)僅發(fā)現(xiàn) 132 個(gè)共有 ER 基序半位點(diǎn)（即 '1-AGGTCA'），這表明 NUTF2 通過間接機(jī)制調(diào)節(jié) ER 染色質(zhì)占有率和活性。為了更清楚的了解NUTF2 生長(zhǎng)抑制的分子機(jī)制，研究者完成了 MCF-7 和 MCF-7NUTF2 細(xì)胞的 RNA-seq，基因集富集分析表明在 600 多個(gè)差異表達(dá)基因中，包括上調(diào) RNA 分解代謝相關(guān)基因、NuRD 復(fù)合物成分（如 HDAC1）和凋亡基因 ERRFI1、下調(diào)線粒體氧化磷酸化相關(guān)基因（如 BCL2）和致癌基因（如 RAS 家族基因）。通路富集分析表明，這些基因涉及多種癌癥和 EGFR 相關(guān)通路，支持 NUTF2 作為 EGFR 信號(hào)效應(yīng)因子的作用。ERα-APEX2 鄰近蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示，NUTF2 表達(dá)會(huì)改變 ER 的相互作用組，包括 JunB 標(biāo)記增加、腫瘤抑制因子 HSPBP1 和 CSDE1 標(biāo)記減少等。對(duì)比 NUTF2:WT 與 NUTF2:K4Q 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) ER 相互作用組存在差異（如 CNOT9 標(biāo)記增加、DNMT3A 標(biāo)記減少），進(jìn)一步證實(shí) NUTF2 通過調(diào)控 ER 相關(guān)蛋白相互作用影響通路。

圖13：NUTF2-ER的相互作用

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四

結(jié)論與意義

1

nTDP 方法學(xué)的成功建立與應(yīng)用

該研究?jī)?yōu)化 nTDP workflow，結(jié)合離線原生尺寸排阻色譜（nSEC）、納米電噴霧電離（nano-ESI）、場(chǎng)不對(duì)稱離子遷移譜（FAIMS）和多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜（MSn），成功從乳腺癌細(xì)胞（MCF-7 及MCF-7 -EGFR ）中鑒定出 17 種蛋白質(zhì)復(fù)合物的 104種 complexoforms，包括 蛋白- 金屬?gòu)?fù)合物、蛋白-蛋白- 金屬?gòu)?fù)合物、蛋白-蛋白復(fù)合物等，且能表征≤70 kDa 的內(nèi)源性蛋白質(zhì)組裝體，克服了傳統(tǒng)方法在復(fù)雜生物樣本中分析低豐度蛋白質(zhì)復(fù)合物的局限。

2

關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物的發(fā)現(xiàn)與功能解析

識(shí)別了與癌癥相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)復(fù)合物，如磷酸丙糖異構(gòu)酶（TPI）、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）、超氧化物歧化酶（SOD1）的 complexoforms，明確了其翻譯后修飾（PTMs）位點(diǎn)（如 TPI 的脫酰胺、磷酸化，MIF 的亞硝基化、乙?；琒OD1 的金屬結(jié)合位點(diǎn)等）及其對(duì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能的影響。核心發(fā)現(xiàn)：EGFR 過表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)運(yùn)因子 2（NUTF2）二聚體解離。NUTF2 二聚體作為核孔穿梭蛋白參與 RAN 的核輸入，其過表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而不同 PTM 位點(diǎn)（K4 和 K55）的突變會(huì)逆轉(zhuǎn)或加劇這一抑制效應(yīng)，表明 NUTF2 的 PTMs 通過調(diào)節(jié)雌激素受體（ER）信號(hào)通路影響乳腺癌生長(zhǎng)。

3

NUTF2 與乳腺癌內(nèi)分泌抵抗的關(guān)聯(lián)機(jī)制

NUTF2 通過間接調(diào)節(jié) ER 的 DNA 結(jié)合和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)影響 ER 信號(hào)通路，例如下調(diào)雌激素誘導(dǎo)的增殖基因 GREB1，上調(diào)凋亡基因 ERRFI1 等，從而抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。EGFR 過表達(dá)（內(nèi)分泌治療抵抗模型）會(huì)減少 NUTF2 二聚體水平，改變其 PTMs 模式，導(dǎo)致 NUTF2 對(duì) ER 信號(hào)的調(diào)控作用異常，可能是 EGFR 介導(dǎo)的他莫昔芬抵抗的重要機(jī)制之一。

4

nTDP 的領(lǐng)域意義

該方法為復(fù)雜生物樣本中內(nèi)源性蛋白質(zhì)復(fù)合物的大規(guī)模分析提供了新范式，能夠保留脆弱的非共價(jià)相互作用，精準(zhǔn)表征 proteoform 的 PTMs、組裝模式及配體結(jié)合，為癌癥生物學(xué)、藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究開辟了新途徑，尤其為理解乳腺癌治療抵抗的分子機(jī)制提供了關(guān)鍵見解。

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