一、接種骨髓間充質干細胞

取對數(shù)生長期的細胞，按照2×105cells/cm2的細胞密度接種至包被后的細胞培養(yǎng)皿中，將接種好的細胞培養(yǎng)皿放到37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期觀察細胞增殖狀態(tài)，當細胞融合度達60-70%時，棄掉上清，加入成骨誘導分化培養(yǎng)基。

二、細胞分化誘導

每2-3天進行換液（定期觀察是否有污染），再放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約2-3周，并注意觀察細胞形態(tài)變化。根據(jù)細胞鈣鹽結晶析出和鈣質結節(jié)形成的情況，決定終止細胞誘導的時間，進行下一步染色鑒定。

三、細胞固定

用吸頭（確保吸取充分）吸去培養(yǎng)基使用適量1×PBS清洗一次，棄去后取適量4%中性甲醛溶液細胞培養(yǎng)皿底面，室溫固30-60min，棄去固定液再使用1×PBS清洗兩次。

四、茜素紅染色

加入適量茜素紅染液染3-5min，吸去茜素紅染液，用1×PBS清洗兩次，并加入適量1×PBS避免細胞干燥。

五、誘導評估

顯微鏡下觀察成骨染色效果，并進行圖像采集和誘導評估。誘導成功時，鈣質結節(jié)會與茜素紅染料結合后呈現(xiàn)紅色或橘紅色。