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質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的操作步驟
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的操作步驟
轉(zhuǎn)染(transfection)是細(xì)胞在一定條件下主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過(guò)程。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)于哺乳細(xì)胞蛋白的表達(dá)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)染的方法和步驟直接影響著轉(zhuǎn)染的成功與否。那么你知道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的操作步驟有那些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！
以24孔板培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例：
一、種細(xì)胞；
1. 貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天每孔0.5-2×10E5個(gè)細(xì)胞接種于500ul培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞可長(zhǎng)至90-95%匯合度。
2. 懸浮細(xì)胞：在配置轉(zhuǎn)染液前每孔4-8×10E5個(gè)細(xì)胞接種于500ul培養(yǎng)基中。
二、轉(zhuǎn)染液配置，每孔細(xì)胞用量如下：
1. 用50ul無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒DNA，輕輕混勻。
2. 取適量合適的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑在50ul無(wú)血清培養(yǎng)基中稀釋，室溫孵育5min。
3. 將前兩步所稀釋的DNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑混合，輕輕混勻，室溫放置30min。
三、在每孔細(xì)胞中加入混合后的轉(zhuǎn)染液，輕輕搖勻。
四、貼壁細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染4-6h后更換培養(yǎng)基，懸浮細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染后18-48h間進(jìn)行細(xì)胞換液，轉(zhuǎn)染18-48h后可檢測(cè)基因mRNA水平表達(dá)。如果檢測(cè)蛋白表達(dá)，需在轉(zhuǎn)染后48-72h收集細(xì)胞樣品。
五、對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24h后以1:10傳代培養(yǎng)，第二天可加入選擇培養(yǎng)基。
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