圖3（上下滑動(dòng)閱覽）：手動(dòng)設(shè)門策略。用于識(shí)別主要免疫細(xì)胞亞群的設(shè)門策略通過箭頭說明繪圖之間的關(guān)系，并通過編號(hào)標(biāo)簽對應(yīng)下面描述的人群。在排除雙聯(lián)體和碎片后，嗜堿性粒細(xì)胞（1）被鑒定為CD45?CD123?HLA-DR?。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（2）根據(jù)FSC-A和SSC-A特性設(shè)門。單核細(xì)胞（3）根據(jù)CD14和CD16表達(dá)進(jìn)一步分為經(jīng)典（CD14??CD16?）、中間（CD14??CD16?/low）和非經(jīng)典（CD14?CD16?）亞群。從淋巴細(xì)胞門（2）中，區(qū)分出三個(gè)群體：CD3?TCRγδ?、CD3?TCRγδ?和CD3?TCRγδ?（4）。CD3?TCRγδ?亞群（5）根據(jù)CD45RA和CCR7表達(dá)進(jìn)一步表征。CD3?TCRγδ?群體被分為CD3?CD56?（NK T樣）和CD3?CD56?亞群（6），并使用CD2和CD8表達(dá)對NK T樣細(xì)胞進(jìn)行額外分類（7）。從CD3?TCRγδ?門中，鑒定出CD4?、CD8?、CD4?CD8?和CD4?CD8? T細(xì)胞（8）。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）從CD4?群體中通過CD127low和CD25high表達(dá)設(shè)門，并使用CD39和CD45RA進(jìn)一步表征（9）。使用CCR7、CD45RA、CD27和CD28定義CD4?和CD8? T細(xì)胞的記憶和效應(yīng)亞群（10, 11）。B細(xì)胞在CD3?TCRγδ?群體中被鑒定為CD19?和/或CD20?（12）。它們被進(jìn)一步分類為IgD?CD27?（初始B細(xì)胞）、IgD?CD27?（未轉(zhuǎn)換記憶B細(xì)胞）和IgD?CD27?亞群。IgD?CD27?群體根據(jù)CD20表達(dá)細(xì)分為漿母細(xì)胞和IgD?記憶B細(xì)胞，并在記憶區(qū)室內(nèi)評估了IgG和IgM表達(dá)（13）。自然殺傷（NK）細(xì)胞被定義為CD3?TCRγδ?HLA-DR?，并分類為早期（CD56??CD16?）、成熟（CD56?CD16?）和終末（CD56?CD16?）亞群（14）。樹突狀細(xì)胞（DCs, 15）被鑒定為CD3?CD19?CD56?CD14?HLA-DR?，并進(jìn)一步分離為漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（CD123?）和經(jīng)典樹突狀細(xì)胞（CD11c?）。CD11c? DCs進(jìn)一步分為CD16?和CD16?亞群，然后使用CD1c和CD141表達(dá)進(jìn)行分類。最后，固有淋巴樣細(xì)胞（ILCs, 16）被定義為CD3?CD19?CD20?CD14?CD123?CD127?，并根據(jù)CD2和CD4表達(dá)進(jìn)一步分亞群。所有呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)均來自一個(gè)有代表性的健康供體。

圖4（上下滑動(dòng)閱覽）：通過優(yōu)化活/死染色前的洗滌條件改善CXCR3和CXCR5染色。頂行（A–F）：裂解的血樣用PBS洗滌，然后用ViaKrome 808染色進(jìn)行活/死鑒別，隨后用含1% FBS的PBS洗滌進(jìn)行熒光標(biāo)志物染色。圖B和圖C分別顯示CXCR5和CXCR3的單染對照。圖D顯示在無蛋白緩沖液中用ViaKrome單染的活/死細(xì)胞；圖E顯示CD3?CD4? T細(xì)胞，圖F顯示多色樣本中CXCR5和CXCR3表達(dá)降低。底行（G-L）：在ViaKrome染色前，細(xì)胞用含1% FBS的PBS洗滌，這恢復(fù)了CXCR5和CXCR3的表達(dá)并改善了細(xì)胞回收率。圖H和圖I顯示CXCR5和CXCR3的單染對照，圖J顯示在存在1% FBS的情況下單染ViaKrome 808，區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的能力沒有降低，圖K顯示CD3?CD4? T細(xì)胞，圖L顯示多色樣本中恢復(fù)的CXCR5和CXCR3表達(dá)。注意：測試了多個(gè)變量，包括不同批次和貨號(hào)的ViaKrome染料、CXCR5和CXCR3抗體以及FBS。然而，關(guān)鍵的改進(jìn)是在ViaKrome染色前使用1% FBS洗滌觀察到的。