利用腸道芯片和4D成像了解病原體入侵

1 摘要

1.1 實時機械生物學(xué)研究挑戰(zhàn)

在病原體與人體之間復(fù)雜的相互作用過程中，機械信號發(fā)揮著重要作用，它決定著基因表達、黏附動力學(xué)，甚至形態(tài)發(fā)生。從細(xì)胞外基質(zhì)的密度、泌尿道中流體流動的剪切力，到血管的迂曲程度，機械生物學(xué)領(lǐng)域與基礎(chǔ)生物學(xué)過程緊密交織。然而，要實時捕捉這些動態(tài)變化，尤其是在像腸道這樣復(fù)雜的微環(huán)境中，一直是一個難題，因為共聚焦顯微鏡的成像速度太慢，無法對腸道蠕動進行成像 [1] 。

1.2 腸道芯片模型

器官芯片（OoC）技術(shù)的發(fā)展為研究機械生物學(xué)事件開辟了新的契機。該技術(shù)所構(gòu)建的微型生態(tài)系統(tǒng)能夠以較高的保真度模擬生理條件，尤其適用于研究那些僅在人類中出現(xiàn)且無法在動物模型中復(fù)制的病癥。通過整合多種細(xì)胞類型以及有助于維持體內(nèi)平衡條件的多孔膜，器官芯片平臺在引入諸如流體流動和蠕動等關(guān)鍵要素的同時，還能模擬器官的微觀結(jié)構(gòu)。但要獲得全面的研究見解仍面臨諸多障礙，尤其是在實現(xiàn)實時三維成像以及研究瞬時事件方面。

該研究涉及兩種病原體的入侵機制：

1.2.1 溶組織阿米巴變形蟲（導(dǎo)致阿米巴?。?/span>

阿米巴病是由溶組織阿米巴變形蟲引起的，溶組織阿米巴變形蟲是一種專門攻擊人類的寄生蟲。雖然許多感染沒有癥狀，但一旦寄生蟲突破腸道內(nèi)壁，就會引發(fā)疼痛性腹瀉，并伴有出血和潰瘍形成。更嚴(yán)重的話，阿米巴病可能會升級為肝臟、肺和腦等重要器官膿腫的形成。

圖1 溶組織內(nèi)阿米巴（紅色輪廓）正在破壞人類結(jié)腸的粘液層

1.2.2 志賀氏菌（導(dǎo)致志賀氏菌病的細(xì)菌）

志賀菌病由志賀菌感染引起，志賀菌是大腸桿菌的不同變種。這些細(xì)菌攜帶著一種毒力質(zhì)粒，使其能夠僅侵入人類腸道上皮細(xì)胞，隨后侵入黏膜層。這種入侵會引發(fā)嚴(yán)重的炎癥，并伴隨著廣泛的組織損傷。

圖2 志賀菌侵入人類腸道上皮細(xì)胞

2 研究目的

這項工作目的是在周期性變形條件下對芯片器官進行四維實時成像，模擬腸道的蠕動運動。除了實現(xiàn)可視化之外，這種方法還能揭示組織的流變學(xué)特性，為深入了解機械應(yīng)力的時空分布提供了新的視角。該研究以腸道屏障為重點，展現(xiàn)了機械信號與病原體侵襲之間的相互作用，突出了溶組織內(nèi)阿米巴和志賀氏菌的致病機制。

研究觀察了多種參數(shù)：宿主細(xì)胞的死亡情況、組織的連接性、病原體的追蹤、入侵及定殖情況，以及應(yīng)力相關(guān)性。

3 實驗設(shè)置

3.1 材料

l 腸道芯片

l T2i 旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡

l ORCA-Flash 4.0 數(shù)字 CMOS 相機

l OB1 MK3+ 流量控制器

l MSF 流量傳感器

l Elveflow 軟件界面

圖3 從細(xì)胞培養(yǎng)到數(shù)據(jù)分析的端到端工作流程示意圖

3.2 4D實時成像優(yōu)化

首先，在蠕動條件下獲取視頻面臨多項挑戰(zhàn)，本研究已解決：

l 對齊問題：視頻序列通常與周期性蠕動運動不同步。為了解決這個問題，有必要將其對齊到一個四維數(shù)據(jù)堆棧中，同時要考慮到周期之間的時間延遲。

l 組織曲率：組織的曲率可能導(dǎo)致圖像失焦，這就需要進行二維投影處理。

l 運動校正：可能發(fā)生平面外運動，需要運動校正技術(shù)來確保成像準(zhǔn)確。

3.3 腸道芯片感染實驗
腸道芯片包含兩個腔室。上腔室灌注有培養(yǎng)基，并培養(yǎng)著Caco2細(xì)胞，而下腔室則專門用于灌注培養(yǎng)基。一塊橫向的膜能夠進行機械拉伸，以模擬腸道的蠕動運動。隨后通過向該系統(tǒng)中注入受感染的培養(yǎng)物，從而實現(xiàn)了細(xì)菌和類變形蟲的感染。

3.4 微流體蠕動應(yīng)力設(shè)置
該微流控裝置通過點成Elveflow的 ESI 軟件進行監(jiān)控，并使用 OB1壓力控制器在三通道設(shè)置下進行監(jiān)測（見圖 4）：

l 通道 1：向腸道芯片的頂部通道灌注培養(yǎng)基，該通道內(nèi)含有Caco2細(xì)胞（源自人類結(jié)腸的上皮細(xì)胞）。連接MFS流量傳感器（流速為每小時30微升）。

l 通道 2：向腸道芯片的底部通道灌注培養(yǎng)基。連接MFS流量傳感器（流速為每小時30微升）。

l 通道 3：進行側(cè)向真空拉伸操作，以模擬結(jié)腸的蠕動（幅度為10%，頻率為0.15Hz）。

圖4 點成Elveflow 微流體裝置采用芯片模擬腸道，以重現(xiàn)蠕動運動

4 主要發(fā)現(xiàn)

實驗控制參數(shù)說明：WP：存在類似蠕動的拉伸；WOP：不存在類似蠕動的拉伸；福氏志賀菌 - mxiD：無毒菌株；TSAR 福氏志賀菌菌株在三型分泌系統(tǒng)（T3SS）激活時會表達綠色熒光蛋白（GFP）（這是毒力基因誘導(dǎo)的標(biāo)志物，可使細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞）；半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）可抑制變形蟲對細(xì)胞膜的降解作用。

4.1 組織流變學(xué)模型的建立

為了比較局部應(yīng)力和局部毒力，建立了一個組織流變學(xué)研究模型。然而，芯片的封裝結(jié)構(gòu)使得無法使用流變學(xué)探針，并且與壓力泵指令相比，聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架會改變機械性能。因此，基于視頻分析開發(fā)了一個可靠的數(shù)學(xué)模型來應(yīng)對這些挑戰(zhàn)。

4.2 福氏志賀氏菌的動態(tài)入侵過程

為了研究福氏志賀菌的感染動態(tài)，研究人員在感染后的 1 至 2 小時內(nèi)持續(xù)進行監(jiān)測，并將結(jié)果與無毒菌株（福氏志賀菌 - mxiD）進行對比。他們觀察了兩個關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)菌菌落的擴展程度以及單個細(xì)菌侵入所需的時間。

4.2.1蠕動促進細(xì)菌定殖，使其更早開始且擴展更迅速

事實上，隨著蠕動運動的發(fā)生，細(xì)菌數(shù)量顯著增加（圖 5A）。此外，在感染后的最初 2 小時內(nèi)，TSAR（三型分泌系統(tǒng)激活相關(guān)指標(biāo)）的激活經(jīng)歷了兩個不同階段，這表明在有蠕動的情況下，毒力基因會更早且更廣泛地被誘導(dǎo)激活（圖 5B）。

圖5 福氏志賀氏菌的組織入侵 

A) 生長菌落中的細(xì)菌數(shù)量 (N=8)，B) 作為其分泌系統(tǒng)標(biāo)記的 TSAR 激活細(xì)菌數(shù)量示例曲線 (N=4)

4.2.2 局部機械應(yīng)力加速細(xì)菌在細(xì)胞間的傳播

研究人員通過比較單個細(xì)菌中 TSAR 的激活速度，來探究局部機械應(yīng)力對福氏志賀菌的影響。為了實現(xiàn)這一目的，利用藍(lán)色膜探針 Pro12A 計算出組織的應(yīng)力圖譜，并將其與單個細(xì)菌的 TSAR 激活情況進行對比。如圖 6 所示，研究人員觀察到，在上皮應(yīng)力較高的區(qū)域，細(xì)菌的激活時間明顯更早。

圖6 疊加了 TSAR 激活時間的應(yīng)力圖（一個周期的平均值）；

每個點對應(yīng)于跟蹤激活的 (x, y) 坐標(biāo)（越暗，激活時間越快）

4.3 溶組織內(nèi)阿米巴原蟲的動態(tài)侵襲過程

在對溶組織內(nèi)阿米巴的感染研究中，研究人員采用了嚴(yán)格的 7 小時監(jiān)測期，以 30 分鐘或 1 小時為間隔進行觀察，并與使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）來防止細(xì)胞降解的對照組進行對比。研究人員觀察了三個關(guān)鍵參數(shù)：細(xì)胞死亡情況、組織連接性以及病原體的侵入情況。

4.3.1 蠕動促進類變形蟲對組織的降解和侵襲

通過熒光顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)，與靜態(tài)組織（無蠕動，即 WOP）相比，在類變形蟲感染 3 小時后，有蠕動（WP）的情況下細(xì)胞死亡率增加了 10%（圖 7A）。為了研究組織損傷情況，研究人員還觀察了細(xì)胞的連接性，結(jié)果顯示在受到感染后約 3 至 4 小時出現(xiàn)了連接失效的情況（圖 7B）。

圖7 變形蟲感染后在蠕動條件下的組織降解

A) 死細(xì)胞占總死細(xì)胞的百分比(N=8)?；贓-鈣粘蛋白連接的組織連接性評估(N=6)

組織降解的過程也通過熒光顯微鏡進行了觀察（圖 8）。簡而言之，在感染過程中，溶組織內(nèi)阿米巴（紅色）降解了刷狀緣上的肌動蛋白（紫色），吞噬了死亡細(xì)胞（黃色），并切斷了 E - 鈣黏蛋白（綠色）連接。本研究闡明，蠕動運動積極地促進了這一過程，突顯了感染機制與組織力學(xué)之間的緊密聯(lián)系。

圖8 類變形蟲感染后1小時和3小時的組織降解及侵襲過程。

紅色：變形蟲；紫色：肌動蛋白；綠色：E-鈣黏蛋白；黃色：死亡細(xì)胞（比例尺為20微米）。

溶組織內(nèi)阿米巴分泌的半胱氨酸蛋白酶對于高效降解和侵入人體結(jié)腸組織至關(guān)重要。在使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）的芯片實驗條件下，無論是有蠕動（WP）還是無蠕動（WOP）的情況，都未再觀察到組織降解和寄生蟲侵入的現(xiàn)象（圖 9）。這凸顯了半胱氨酸蛋白酶活性在有效分解和侵入組織過程中的關(guān)鍵作用，同時也驗證了芯片上器官（OoC）是研究阿米巴病初始階段的一個準(zhǔn)確模型。

圖9 變形蟲感染7小時后的共聚焦z軸層疊圖像。

左側(cè)為未使用半胱氨酸蛋白酶抑制劑的情況，右側(cè)為使用了半胱氨酸蛋白酶抑制劑（E64）的情況，

上方為存在蠕動運動的情況，下方為不存在蠕動運動的情況。

4.3.2 局部機械應(yīng)力增強類變形蟲的入侵能力

最終研究確定，與沒有蠕動的情況相比，蠕動會減少變形蟲在上皮組織上的遷移，從而有助于其侵入組織。通過使用與分析局部應(yīng)力相同的關(guān)聯(lián)方法，將單個變形蟲的侵入速度與局部應(yīng)力水平進行比較后發(fā)現(xiàn)，從統(tǒng)計學(xué)角度來看，在由蠕動運動引發(fā)的較高應(yīng)力區(qū)域，寄生蟲侵入成功的概率更高。

5 結(jié)論

蠕動在腸道組織更新過程中發(fā)揮著作用，它能促使上皮細(xì)胞和微生物群脫落。抑制胃腸蠕動通常會導(dǎo)致細(xì)菌過度生長，這表明蠕動運動對于降低感染風(fēng)險從根本上來說至關(guān)重要。然而，研究結(jié)果表明，盡管福氏志賀菌和溶組織內(nèi)阿米巴在大小、生命周期和感染機制上存在顯著差異，但蠕動運動卻是這兩種病原體侵入的決定性因素。這些病原體已經(jīng)進化到能夠利用結(jié)腸環(huán)境信號，這意味著我們需要重新審視在靶器官生態(tài)位中研究宿主與病原體相互作用的方式。蠕動運動和局部機械應(yīng)力對這兩種病原體感染的影響概述如圖 10 所示。

圖10 蠕動運動和局部機械應(yīng)力對福氏志賀菌和溶組織內(nèi)阿米巴侵襲策略的影響。

使用Biorender軟件繪制。

引用
[1] A. Boquet-Pujadas et al., “4D live imaging and computational modeling of a functional gut-on-a-chip evaluate how peristalsis facilitates enteric pathogen invasion,” 2022. [Online]. 

[2] A. Grassart et al., “Bioengineered Human Organ-on-Chip Reveals Intestinal Microenvironment and Mechanical Forces Impacting Shigella Infection,” Cell Host Microbe, vol. 26, no. 3, pp. 435-444.e4, Sep. 2019, doi: 10.1016/j.chom.2019.08.007.