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DNA合成儀是合成生物學(xué)、分子生物學(xué)和基因組學(xué)研究的基石設(shè)備，其核心功能是將單個(gè)核苷酸(A,T,C,G)按照預(yù)設(shè)序列逐鏈組裝成寡核苷酸，并進(jìn)一步拼接成基因乃至更長片段。其技術(shù)原理主要基于固相亞磷酰胺化學(xué)合成法，這是一個(gè)高度自動(dòng)化、循環(huán)進(jìn)行的化學(xué)過程。
整個(gè)過程在固相支持物上進(jìn)行，通常是一種可控孔徑玻璃珠(CPG)。合成從鏈的3‘端向5’端進(jìn)行。一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的合成循環(huán)包含以下四個(gè)關(guān)鍵步驟：
1.脫保護(hù)：在第一個(gè)循環(huán)開始前，連接在CPG上的第一個(gè)核苷酸(其3‘端已固定)的5’末端通常被一個(gè)二甲氧基三苯基(DMT)保護(hù)基團(tuán)封閉。循環(huán)的第一步是用酸的溶液流過柱床，選擇性地去除這個(gè)DMT保護(hù)基，暴露出一個(gè)活性的5‘-羥基，為下一個(gè)核苷酸的連接做好準(zhǔn)備。
2.偶聯(lián)：在活化劑(如四唑類化合物)的存在下，下一個(gè)帶有5‘-DMT保護(hù)的核苷亞磷酰胺單體(其3’端被活化)被泵入反應(yīng)柱。新單體的活化3‘磷酸基團(tuán)與上一步暴露出的5’-羥基發(fā)生親核反應(yīng)，形成一個(gè)不穩(wěn)定的磷酸三酯鍵，從而將新單體連接到生長的寡核苷酸鏈上。這一步是關(guān)鍵化學(xué)反應(yīng)，其效率直接決定合成鏈的得率和長度。
3.封端：偶聯(lián)步驟并非100%有效，總有少量生長鏈的5‘-羥基未能參與反應(yīng)。這些“失敗鏈”如果不加以處理，將在下一輪循環(huán)中繼續(xù)延伸，產(chǎn)生缺失一個(gè)核苷酸的“缺失序列”雜質(zhì)。為了阻止它們，在偶聯(lián)之后，會(huì)加入乙?；噭?如乙酸酐和N-甲基咪唑的混合物)，與未反應(yīng)的5‘-羥基反應(yīng)，將其“封端”，使其在后續(xù)的合成循環(huán)中一直失活，從而在較終產(chǎn)物中以便于純化的短鏈形式存在。
4.氧化：偶聯(lián)步驟形成的磷酸三酯鍵是三價(jià)磷，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定。通過泵入碘/水/吡啶的氧化溶液，將其氧化為更穩(wěn)定的五價(jià)磷酸三酯鍵，即形成天然DNA分子骨架中的磷酸二酯鍵結(jié)構(gòu)。
上述四個(gè)步驟構(gòu)成一個(gè)完整的合成循環(huán)，為DNA鏈增加了一個(gè)核苷酸。循環(huán)結(jié)束后，用乙腈等溶劑洗滌反應(yīng)柱，去除多余的試劑和副產(chǎn)物，然后重復(fù)整個(gè)過程，直到整條鏈的序列合成完畢。對(duì)于每條獨(dú)立的序列，合成儀會(huì)控制不同的閥門，從四個(gè)獨(dú)立的核苷酸單體儲(chǔ)液瓶中精確輸送特定的單體，實(shí)現(xiàn)序列的精確編碼。
當(dāng)整條寡核苷酸鏈合成完成后，較后的步驟是脫除所有堿基上的保護(hù)基(如苯甲酰基、異丁?；?以及主鏈上的保護(hù)基，并將合成的寡核苷酸從固相支持物上切割下來，通常通過濃氨水處理完成，同時(shí)實(shí)現(xiàn)脫保護(hù)和切割。
對(duì)于長基因的合成，通常先合成多個(gè)較短的、有重疊區(qū)域的寡核苷酸片段。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或酶學(xué)方法，利用這些重疊序列將短片段組裝、連接成完整的雙鏈DNA基因。
從單核苷酸到基因，DNA合成儀通過精密控制的流體系統(tǒng)、高效的化學(xué)反應(yīng)和自動(dòng)化操作，將抽象的基因序列信息轉(zhuǎn)化為可操作的實(shí)體DNA分子，為基因編輯、分子克隆、診斷探針開發(fā)、以及整個(gè)人工生命系統(tǒng)的構(gòu)建提供了較基本的“字母”和“零件”。
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