引言

在生命科學(xué)研究中，Western Blot（WB）作為蛋白質(zhì)分析的核心技術(shù)，正經(jīng)歷著很大的變革與創(chuàng)新，成為國家自然科學(xué)基金資助的重要領(lǐng)域。Western Blot（蛋白免疫印跡）技術(shù)自1979年發(fā)明以來，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域不能少的蛋白質(zhì)分析工具。近年來，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新和完善，WB領(lǐng)域涌現(xiàn)出許多熱點研究方向。這些方向不僅涉及技術(shù)本身的優(yōu)化與創(chuàng)新，還包括其在疾病機制研究、生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)及藥物開發(fā)等方面的應(yīng)用。這些研究方向也成為國家自然科學(xué)基金（國自然）重點支持的熱點領(lǐng)域。

本文將圍繞WB技術(shù)的創(chuàng)新與應(yīng)用，探討幾個國自然熱點話題，為科研工作者提供思路和參考。

如何突破傳統(tǒng)WB技術(shù)的靈敏度與通量瓶頸？

傳統(tǒng)WB技術(shù)存在操作繁瑣、耗時較長、重復(fù)性差等問題。在涉及低豐度蛋白檢測時，靈敏度不足容易導(dǎo)致假陰性結(jié)果。同時，傳統(tǒng)WB的手動操作步驟多，實驗結(jié)果易受人為因素影響，重復(fù)性差，難以滿足高質(zhì)量研究的需求。

近年來，多項新技術(shù)正致力于解決這些瓶頸問題。延邊大學(xué)李東浩教授團隊開發(fā)的"靶型免疫印跡"（Concentric-Type Immunoblotting, CIB）新技術(shù)采用環(huán)形非均勻電場驅(qū)動，使蛋白質(zhì)的電遷移距離和電泳速度分別提高了1.47倍和1.75倍（以15 kDa蛋白為例），整體分離時間比傳統(tǒng)WB顯著縮短了3.33倍。

這種技術(shù)通過梯度變化的電場作用顯著提升了電遷移速度，對高、中、低分子量蛋白質(zhì)的分辨率分別提高了2.39、1.89和3.54倍，對TSG101、CD9和Alix等外泌體蛋白的檢測靈敏度分別提升了2.11倍、3.88倍和2.38倍。

Simple Western毛細(xì)管免疫分析技術(shù)則采用全自動毛細(xì)管電泳免疫分析系統(tǒng)，將單次分析時間從WB的數(shù)天縮短至3小時，蛋白需求降低10倍。這種技術(shù)避免了轉(zhuǎn)膜變異，自動峰識別提升了重復(fù)性，兼容96孔板高通量篩選，為神經(jīng)退行性疾病的生物標(biāo)志物開發(fā)和治療評估樹立了新標(biāo)準(zhǔn)。

自動化工作站也是WB技術(shù)發(fā)展的重要方向。艾普拜生物推出的Auto 12全自動蛋白印跡工作站，能夠自動完成膜的封閉、一抗孵育、二抗孵育和清洗，支持12通道，各通道可獨立設(shè)置程序，通量靈活，最多可一次處理24張膜。

這種自動化操作不僅減少了人工操作的繁瑣和誤差，還通過流體清洗減少二抗在膜上的附著，降低背景，提高信噪比和相對靈敏度。

表格1：傳統(tǒng)WB技術(shù)與創(chuàng)新技術(shù)的性能對比

這些技術(shù)的創(chuàng)新不僅解決了傳統(tǒng)WB的痛點問題，也為WB技術(shù)在國自然基金中的應(yīng)用提供了新的方向。研究者可以基于這些技術(shù)創(chuàng)新，設(shè)計更具創(chuàng)新性和可行性的研究方案，提高國自然基金申請的競爭力。

如何實現(xiàn)WB數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)量化與標(biāo)準(zhǔn)化？

數(shù)據(jù)可重復(fù)性是WB研究面臨的主要挑戰(zhàn)之一。中國生物技術(shù)發(fā)展中心2025年調(diào)研顯示：76.5%的科研機構(gòu)因印跡分析誤差導(dǎo)致論文返修，43%的產(chǎn)業(yè)化項目因此延誤申報進度。

內(nèi)參蛋白的選擇策略

內(nèi)參蛋白的選擇對于WB數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)量化至關(guān)重要。常用的內(nèi)參基因如GAPDH和β-actin在不同的實驗條件下，其表達(dá)穩(wěn)定性可能會受到多種因素的影響。

美國西部衛(wèi)生科學(xué)大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)，在豬肩袖肌腱組織研究中，14-3-3ζ在正常和高血脂條件下均表現(xiàn)出穩(wěn)定的表達(dá)模式，是WB分析的可靠內(nèi)參蛋白。

選擇內(nèi)參蛋白時需要考慮多個因素：

?樣本類型：對于全細(xì)胞樣本，β-actin和GAPDH是常用選擇，但在脂肪組織、肌肉組織實驗中需謹(jǐn)慎使用；

?實驗條件：在涉及能量代謝異常的實驗?zāi)Ｐ停ㄈ缛毖?、糖尿病模型）中，GAPDH不適用；

?亞細(xì)胞定位：研究細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)實驗時，Vinculin可能是理想內(nèi)參；

成像與數(shù)據(jù)分析的創(chuàng)新

LI-COR Biosciences公司的Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)可以實現(xiàn)定量Western Blot檢測，具有重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、多色熒光成像等特點。

這種系統(tǒng)不僅可以在同一張膜上同時成像多個條帶，無需剪膜，滿足了期刊雜志對于目的蛋白和內(nèi)參蛋白在同一膜上成像的要求，還能在進行蛋白質(zhì)磷酸化分析時，使用不同熒光基團標(biāo)記的二抗，同時檢測磷酸化蛋白水平和該蛋白的總水平。

智能分析系統(tǒng)也是WB數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化的重要方向。觀遠(yuǎn)數(shù)據(jù)智能分析平臺通過AI算法重構(gòu)、云端協(xié)作和全自動成像三大模塊，將電泳檢測效率提升82%，錯誤率降低至0.3%以下。

該系統(tǒng)采用480-850nm寬波段捕捉，成功解析低豐度蛋白條帶（＜0.1ng），并通過區(qū)塊鏈數(shù)據(jù)存證，每個檢測批次生成NIST認(rèn)證的時間戳，保證了數(shù)據(jù)的可靠性和可追溯性。

WB技術(shù)在外泌體研究中有哪些創(chuàng)新應(yīng)用？

外泌體作為細(xì)胞間通訊載體，其攜帶的蛋白質(zhì)分子不僅包含來源細(xì)胞的"分子指紋"，還能動態(tài)反映生理病理狀態(tài)，因此外泌體蛋白質(zhì)的檢測在疾病早期診斷、療效評估及預(yù)后中具有重要作用。

由于生物流體中復(fù)雜成分的干擾、外泌體蛋白質(zhì)之間表達(dá)差異大、外泌體樣本量少以及蛋白質(zhì)含量低等問題，對外泌體蛋白的分離及檢測方法的靈敏度提出了巨大挑戰(zhàn)。

延邊大學(xué)李東浩教授團隊開發(fā)的靶型免疫印跡新技術(shù)為外泌體蛋白質(zhì)研究提供了有效解決方案。該技術(shù)通過環(huán)形非均勻電場結(jié)合Western blot的方法，實現(xiàn)了外泌體蛋白的同時分離和高靈敏檢測。

研究人員利用可以覆蓋外泌體蛋白分子量的蛋白Marker（15-150 kDa）作為模型構(gòu)建CIB中的蛋白質(zhì)同時分離檢測方法，巧妙利用環(huán)形非均勻電場梯度變化特征，創(chuàng)建在CIB中的螺旋型進樣方法，系統(tǒng)性評價不同半徑下的梯度電場驅(qū)動對蛋白質(zhì)的電遷移差異分離行為。

研究表明，CIB對TSG101、CD9和Alix等外泌體蛋白的檢出限分別為0.25 μg、0.6 μg和2.0 μg，而傳統(tǒng)WB的檢出限分別為0.75 μg、0.9 μg和4.0 μg。這種技術(shù)的優(yōu)勢在于由于其環(huán)形幾何特性在中心區(qū)域同心收斂帶來高效濃縮效應(yīng)，提高了檢測靈敏度，可以解決WB檢測中的假陰性問題，有望成為普適性、通用型的檢測蛋白質(zhì)工具。

外泌體蛋白檢測技術(shù)的創(chuàng)新為疾病生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了新途徑，這也是國自然基金重點關(guān)注的熱點領(lǐng)域之一。研究者可以基于這些技術(shù)創(chuàng)新，設(shè)計針對特定疾病的外泌體生物標(biāo)志物研究方案，提高國自然基金申請的創(chuàng)新性和可行性。

如何應(yīng)對翻譯后修飾研究中的抗體特異性挑戰(zhàn)？

翻譯后修飾（PTM）研究是蛋白質(zhì)功能研究的重要領(lǐng)域，也是國自然基金支持的熱點方向。然而，PTM抗體的可靠性問題長期困擾著科研人員。

特別是針對甲基化、乙?；?strong>關(guān)鍵表觀遺傳標(biāo)記的研究常因抗體交叉反應(yīng)導(dǎo)致數(shù)據(jù)失真，這一問題在癌癥等疾病機制研究中尤為突出。

為破解這一困局，研究團隊開發(fā)了兩種革命性技術(shù)：MILKSHAKE（基于修飾麥芽糖結(jié)合蛋白的Western blot驗證系統(tǒng)）和Sundae（基因工程化MBP的ELISA檢測平臺）。前者通過sortase A將合成肽段與修飾MBP/CBD蛋白偶聯(lián)，構(gòu)建出精確控制PTM狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)化抗原；后者則采用"風(fēng)味掃描"策略，可系統(tǒng)評估單個氨基酸殘基對抗體結(jié)合的影響。

研究發(fā)現(xiàn)，甲基化抗體在傳統(tǒng)裂解物驗證中有30%出現(xiàn)誤導(dǎo)性結(jié)論，而MILKSHAKE技術(shù)能有效識別這些隱患。例如，在評估23種商業(yè)化乙?；贵w時，Vanilla MILKSHAKE顯示所有抗體均特異性識別乙?；亩危獺EK293裂解物背景下的Strawberry版本揭示Vendor C抗p53抗體存在顯著脫靶結(jié)合，信號強度比目標(biāo)條帶低3倍。

對于抗體藥物開發(fā)，Sundae平臺可提前預(yù)測臨床候選抗體的表位逃逸風(fēng)險。例如，RSV靶向抗體Motavizumab對pAT158 Sundae蛋白的結(jié)合強度是Palivizumab的3倍（p<0.01），與臨床前數(shù)據(jù)一致。但KRAS G12D抗體在0.3 μg/mL以上濃度時出現(xiàn)G12C交叉反應(yīng)，揭示現(xiàn)有突變特異性抗體存在潛在風(fēng)險。

這些技術(shù)的創(chuàng)新為PTM研究提供了標(biāo)準(zhǔn)化驗證體系，解決了PTM抗體批次間可比性、復(fù)雜樣本背景下假陽性識別和單氨基酸殘基貢獻(xiàn)量化等三大核心問題。對于國自然基金申請者來說，這些技術(shù)創(chuàng)新為解決PTM研究中的抗體特異性問題提供了新思路，有助于設(shè)計更可靠、更創(chuàng)新的研究方案。

WB技術(shù)在神經(jīng)退行性疾病研究中有哪些突破？

神經(jīng)退行性疾病研究是國自然基金重點支持的領(lǐng)域之一，而WB技術(shù)在這些疾病的蛋白質(zhì)異常表達(dá)研究中有重要作用。

多聚谷氨酰胺疾?。╬olyQ）是一類由CAG三核苷酸異常擴增導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病，包括亨廷頓舞蹈癥（HD）、脊髓小腦共濟失調(diào)（SCA1/2/3/6/7/17）等9種類型。這些疾病的共同特征是突變蛋白中多聚谷氨酰胺鏈（polyQ）的異常延長，引發(fā)毒性增益功能。

VICO Therapeutics團隊開發(fā)了基于Simple Western（SW）毛細(xì)管免疫分析的高效定量方法，成功建立了HTT、ATXN1/2/3、ATN1和AR蛋白的檢測體系，并創(chuàng)新性利用caspase 3酶切實現(xiàn)HTT突變/野生型亞型分離。

針對HTT蛋白，研究人員開發(fā)了caspase 3酶切結(jié)合66-440 kDa分離模塊的方案，通過抗體稀釋和蛋白負(fù)載梯度實驗確定檢測體系的線性范圍。

全長HTT無法直接分離亞型，但經(jīng)caspase 3處理產(chǎn)生的N端片段（N-WtHTT~56 kDa，N-MtHTT>59 kDa）在GM09197（18/175 CAG）細(xì)胞中顯示250 kDa條帶，CAG長度與遷移率呈正相關(guān)。

對于ATXN3蛋白，使用抗體ab221143在12-230 kDa模塊中實現(xiàn)52 kDa野生型與70 kDa突變型的分離，信噪比>1400，線性范圍0.05-0.6 mg/mL。

這些技術(shù)的突破為神經(jīng)退行性疾病的機制研究和治療開發(fā)提供了有力工具，也是國自然基金重點支持的熱點領(lǐng)域。研究者可以基于這些技術(shù)創(chuàng)新，設(shè)計針對神經(jīng)退行性疾病的病理機制和治療策略研究方案，提高國自然基金申請的競爭力。

總結(jié)

Western Blot技術(shù)的創(chuàng)新與發(fā)展為生命科學(xué)研究提供了更多可能性，也成為國自然基金支持的熱點領(lǐng)域。從技術(shù)創(chuàng)新到應(yīng)用拓展，從數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化到多維數(shù)據(jù)分析，WB技術(shù)正朝著更靈敏、更準(zhǔn)確、更高效、更自動化的方向發(fā)展。

對于國自然基金申請者來說，關(guān)注WB技術(shù)的最新進展，將其與自己的研究方向有機結(jié)合，設(shè)計創(chuàng)新性強、可行性高的研究方案，將有助于提高基金申請的競爭力。

同時，關(guān)注數(shù)據(jù)可重復(fù)性、標(biāo)準(zhǔn)化和多重驗證等問題，確保研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性，也是國自然基金申請中需要重視的方面。

未來，隨著人工智能、機器學(xué)習(xí)等技術(shù)的不斷發(fā)展，WB數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀將更加精準(zhǔn)和高效，為生命科學(xué)研究提供更多可能性。這些技術(shù)的發(fā)展也將進一步推動WB技術(shù)在國自然基金中的應(yīng)用，為生命科學(xué)研究提供更多支持。

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