ICG（吲哚菁綠）標記蛋白是生物成像、藥物遞送等領域的常用技術(shù)，核心是在溫和條件下實現(xiàn) ICG 與蛋白的共價結(jié)合，同時保留蛋白活性。ICG-NHS 標記蛋白的關(guān)鍵是控制反應 pH、ICG 與蛋白的摩爾比及孵育條件，流程可概括為 “預處理→標記反應→純化→質(zhì)控" 四步，全程需避光操作。
材料預處理：蛋白需經(jīng)透析或凝膠過濾，去除 Tris、甘氨酸等含氨基的緩沖液（避免競爭反應），純度≥90%，濃度調(diào)整為 1-10 mg/mL。
試劑準備：ICG-NHS 酯（常用活性形式）用無水 DMSO 溶解，配制成 10-20 mg/mL 儲備液，現(xiàn)配現(xiàn)用；緩沖液選用 PBS（pH 7.0-8.5）或碳酸鹽緩沖液（pH 8.0-9.0），無氨基干擾。
器材準備：離心管、移液槍、透析袋（截留分子量＜蛋白分子量 1/3）或凝膠過濾柱（如 Sephadex G-25），全程避光（包裹鋁箔）。
按摩爾比 5:1 至 20:1（ICG: 蛋白）計算所需 ICG 儲備液體積，緩慢滴加到蛋白溶液中。
室溫下避光輕柔振蕩孵育 15-60 分鐘，避免劇烈攪拌導致蛋白變性。
若反應體系出現(xiàn)沉淀，需立即終止并降低 ICG 濃度或調(diào)整 pH。
透析法：將反應液轉(zhuǎn)入透析袋，在 PBS 緩沖液中 4℃避光透析 24-48 小時，期間更換 3-4 次緩沖液，去除游離 ICG。
凝膠過濾層析法：用 Sephadex G-25 柱，以 PBS 為洗脫液，搜集吸收峰（蛋白 - ICG 復合物），丟棄后續(xù)游離 ICG 峰。
標記效率驗證：通過紫外 - 可見分光光度法，分別測定 680-800 nm（ICG 特征吸收）和 280 nm（蛋白特征吸收）的吸光度，計算偶聯(lián)率（一般目標 3-8 個 ICG 分子 / 蛋白）。
蛋白活性驗證：采用 ELISA、細胞結(jié)合實驗或酶活性測定，確認標記后蛋白功能未受顯著影響。
穩(wěn)定性驗證：4℃避光儲存 1-2 周，定期檢測吸光度，觀察是否出現(xiàn)聚集或降解。
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