干貨分享 | 實(shí)驗(yàn)室常用蛋白檢測(cè)方法

時(shí)間：2025/5/12閱讀：1358

實(shí)驗(yàn)室超常用的蛋白濃度測(cè)定方法，看這一篇就夠了！選對(duì)方法，實(shí)驗(yàn)效率倍增！

Part1 紫外吸收法(A280法)

蛋白質(zhì)中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）殘基在280nm附近有紫外吸收峰。通過測(cè)量蛋白質(zhì)溶液在 280 nm 處的吸光度值，可以估算蛋白質(zhì)濃度?；贐eer-Lambert定律：A=εbc，其中A是吸光度，ε是摩爾消光系數(shù)，b是光程，c是濃度。對(duì)于蛋白質(zhì)，ε和b在特定條件下可以視為常數(shù)，因此吸光度A與濃度c成正比。通常假設(shè)蛋白質(zhì)的平均消光系數(shù)ε約為1.0(mg/mL)^-1 cm^-1。

The merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

快速簡(jiǎn)便

操作非常簡(jiǎn)單快捷，只需使用紫外分光光度計(jì)直接讀取280nm處的吸光度即可。

非破壞性

樣品可以回收，因?yàn)闇y(cè)量過程中樣品沒有被化學(xué)修飾或消耗。

不需要試劑

除了緩沖液，不需要額外的化學(xué)試劑。

不需要試劑

除了緩沖液，不需要額外的化學(xué)試劑。

The demerits of this method 缺點(diǎn)

干擾多

核酸(DNA,RNA)在 260 nm 處也有很強(qiáng)的紫外吸收，在 280nm 處也有一定吸收，會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定。其他一些小分子物質(zhì)也可能在 280 nm 處有吸收，造成結(jié)果偏差。

靈敏度較低

對(duì)于低濃度的蛋白質(zhì)溶液，吸光度值可能太低，誤差較大。

準(zhǔn)確性受蛋白質(zhì)組成影響

不同蛋白質(zhì)的色氨酸和酪氨酸含量差異很大，導(dǎo)致其摩爾消光系數(shù)差異也很大。使用平均消光系數(shù)進(jìn)行估算，準(zhǔn)確性會(huì)受到蛋白質(zhì)自身氨基酸組成的影響。如果蛋白質(zhì)樣品中Trp 和 Tyr 含量異常高或異常低，誤差會(huì)更大。

需要純凈樣品

樣品中不能含有大量干擾紫外吸收的物質(zhì)，如核酸、某些染料等。

Part2 考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）

考馬斯亮藍(lán)G-250染料在酸性條件下與蛋自質(zhì)結(jié)合，染料從紅色形式（最大吸收波長(zhǎng)在465 nm）轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色形式（最大吸收波長(zhǎng)在595 nm）。這種顏色的轉(zhuǎn)變是由染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后，染料分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起的。結(jié)合主要是通過靜電相互作用和范德華力，特別是染料的磺酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)的堿性氨基酸殘基（如精氨酸、賴氨酸和組氨酸）以及芳香氨基酸殘基的非極性區(qū)域相互作用。顏色的深淺（在595 nm 處的吸光度）與蛋白質(zhì)濃度成正比。

merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

靈敏度較高

比紫外吸收法靈敏度高，適用于測(cè)定較低濃度的蛋白質(zhì)。

操作簡(jiǎn)便快捷

試劑單一，操作步驟少，反應(yīng)迅速，通常幾分鐘內(nèi)即可完成。

受樣品中鹽和緩沖液干擾小

相對(duì)于其他比色法，受樣品中常見的鹽、緩沖液等干擾較小。

穩(wěn)定性好

染色后的藍(lán)色復(fù)合物在室溫下可以穩(wěn)定一段時(shí)間，方便讀取數(shù)據(jù)。

demerits of this method 缺點(diǎn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(通常是牛血清白蛋自BSA)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，才能定量。不同蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合能力有所差異，因此使用 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定其他蛋白質(zhì)，結(jié)果可能存在偏差。

蛋白質(zhì)種類依賴性

不同蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合能力不同，導(dǎo)致對(duì)不同蛋白質(zhì)的定量結(jié)果準(zhǔn)確性不同。堿性氨基酸和芳香氨基酸含量高的蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，反之則可能偏差較大。

試劑會(huì)染色比色皿

考馬斯亮藍(lán)染料容易染色玻璃或塑料比色皿，需要小心操作，或者使用一次性比色皿。

線性范圍有限

在較高蛋白濃度下，反應(yīng)可能出現(xiàn)飽和，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線非線性。

對(duì)去垢劑敏感

一些去垢劑，如SDS，會(huì)干擾Bradford反應(yīng)。

Part3 Lowry法

Lowry法是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法，基于兩個(gè)連續(xù)的化學(xué)反應(yīng)。第一步是蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子在堿性條件下反應(yīng)，形成復(fù)合物，銅離子被還原為亞銅離子。第二步是還原的亞銅離子還原FolinCiocalteu試劑(磷鉬酸和磷鎢酸的混合物)，使試劑顯色，產(chǎn)生藍(lán)色。顏色的深淺(通常在750nm或660nm處測(cè)量吸光度)與蛋白質(zhì)濃度成正比。

merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

靈敏度較高

比紫外吸收法和 Bradford 法更靈敏，可以檢測(cè)更低濃度的蛋白質(zhì)。

受蛋白質(zhì)組成影響相對(duì)較小

因?yàn)槭腔陔逆I反應(yīng)，受不同蛋白質(zhì)氨基酸組成的影響比 Bradford 法小一些。

demerits of this method 缺點(diǎn)

操作步驟繁瑣

需要多個(gè)試劑，操作步驟較多，耗時(shí)較長(zhǎng)。

試劑不穩(wěn)定

Folin-Ciocalteu 試劑不穩(wěn)定，容易受還原性物質(zhì)污染，需要臨用前配制。

干擾多

容易受到多種化學(xué)物質(zhì)的干擾，包括一些緩沖液成分（如Tris，EDTA），以及非離子型去垢劑、還原劑等。需要嚴(yán)格控制樣品和試劑的純度。

時(shí)間依賴性

顯色反應(yīng)需要精確控制反應(yīng)時(shí)間和溫度，反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)或過短都會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

同樣需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Part4 BCA法

BCA法原理與Lowry法類似，也是基于兩個(gè)步驟的反應(yīng)。第一步是蛋白質(zhì)中的肽鍵將銅離子在堿性條件下還原為亞銅離子。第二步是亞銅離子與 BCA試劑(二喹啉甲酸)反應(yīng)，形成紫色的 BCA-Cu*復(fù)合物，該復(fù)合物在 562nm 處有最大吸收。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。

merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

靈敏度高

與 Lowry 法靈敏度相當(dāng)，比 Bradford 法和紫外吸收法高。

操作相對(duì)簡(jiǎn)便

試劑相對(duì)穩(wěn)定，通常試劑以預(yù)混形式提供，操作步驟比Lowry 法簡(jiǎn)化。

受去垢劑干擾小

相對(duì)于 Lowry 法，受一些去垢劑(如 SDS,Triton X-100)的干擾較小，更適用于含有去垢劑的樣品。

線性范圍較寬

BCA法的線性范圍比 Bradford 法寬。

穩(wěn)定性好

顯色后的復(fù)合物比 Bradford 法更穩(wěn)定，可以放置較長(zhǎng)時(shí)間再讀取數(shù)據(jù)。

demerits of this method 缺點(diǎn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

銅離子還原反應(yīng)

基于銅離子還原反應(yīng)，容易受到還原性物質(zhì)的干擾。

時(shí)間和溫度依賴性

反應(yīng)需要加熱孵育，結(jié)果受時(shí)間和溫度影響。

對(duì)脂類物質(zhì)敏感

脂類物質(zhì)會(huì)干擾 BCA反應(yīng)。

Part5 雙縮脲法

雙縮脲法是最早用于蛋白質(zhì)定量的方法之一。在強(qiáng)堿性條件下，含有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物(包括蛋白質(zhì))可以與銅離子反應(yīng)，形成紫紅色的絡(luò)合物。這種絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)在540nm左右。顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。

merits of this method 優(yōu)點(diǎn)

受蛋白質(zhì)組成影響最小

因?yàn)槭侵苯优c肽鍵反應(yīng)，受不同蛋白質(zhì)氨基酸組成差異的影響最小，對(duì)不同蛋白質(zhì)的定量相對(duì)比較準(zhǔn)確。

干擾少

受樣品中常見的鹽、緩沖液、以及一些小分子物質(zhì)的干擾較小。

demerits of this method 缺點(diǎn)

靈敏度低

相對(duì)于 Bradford法、Lowry法和BCA法，靈敏度低，通常只能用于測(cè)定較高濃度的蛋白質(zhì)(>1mg/mL)。

需要大量樣品

由于靈敏度低，需要較高濃度的蛋白質(zhì)樣品和較大量樣品才能獲得可讀的吸光度值。

操作步驟較多

需要配置試劑，操作步驟相對(duì)繁瑣。

標(biāo)準(zhǔn)曲線依賴性

需要使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Part6 相關(guān)耗材推薦

在實(shí)驗(yàn)室蛋白檢測(cè)的各個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)耗材的品質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠性有著重要影響。愛津生物扎根生命科學(xué)領(lǐng)域，憑借多年積累的技術(shù)與持續(xù)創(chuàng)新，擁有一系列適配蛋白檢測(cè)的耗材，包含普通吸頭（低吸附款）、酶標(biāo)板、微量離心管、常規(guī)離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶等。