在傳統(tǒng)代謝組學（包括脂質(zhì)組學，下同）的研究范式中，非靶向代謝組學旨在利用高分辨質(zhì)譜獲得樣本完整代謝輪廓，提供小分子代謝物的廣闊視野；靶向代謝組學主要運用三重四極桿質(zhì)譜，實現(xiàn)關注代謝物的精準定量。隨著大規(guī)模樣本分析需求的擴大，研究者開始尋求代謝組非靶向分析的高覆蓋度和靶向分析高精準度之間的平衡，開創(chuàng)了大規(guī)模代謝組學技術（包括廣泛靶向和擬靶向代謝組學，本文不做區(qū)分）。

大規(guī)模代謝組學關注生物體千余種核心代謝物，直接在三重四極桿質(zhì)譜平臺利用選擇反應監(jiān)測(SRM)或多反應監(jiān)測(MRM)模式采集樣本，在確保代謝物覆蓋度的同時，可以顯著提高低豐度代謝物的檢測靈敏度和特異性，告別非靶向分析中海量信息處理的困擾，提供代謝物檢測更寬的動態(tài)范圍、更穩(wěn)健的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性和相對定量準確性，為大規(guī)模樣本分析提供堅實可靠的數(shù)據(jù)基礎。然而，受制于三重四極桿質(zhì)譜掃描速度的限制，通常每個代謝物只能保留1~2個子離子以確保代謝物分析通量，從而降低代謝物鑒定的可靠性。

Thermo Scientific™ Stellar™質(zhì)譜融合了Orbitrap Ascend™上雙曲面分段四極桿、雙壓線性離子阱，以及Orbitrap Astral™上PMT檢測器，實現(xiàn)了線性離子阱質(zhì)譜前所未有的掃描速度。它開創(chuàng)性地將平行反應監(jiān)測 (Parallel Reaction Monitoring, PRM) 模式從Orbitrap儀器運用到離子阱質(zhì)譜，實現(xiàn)了大規(guī)模代謝組學同步定性定量分析，讓代謝物鑒定準確性和定量可靠性可以兼得。

Thermo Scientific™ Stellar™ 質(zhì)譜儀

01

Stellar MS 支持非靶向高分辨數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，打通“發(fā)現(xiàn)-驗證”閉環(huán)

大規(guī)模代謝組學的經(jīng)典策略之一是將高分辨質(zhì)譜采集的DDA數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為可供SRM模式驗證的scheduled MRM離子對，實現(xiàn)“發(fā)現(xiàn)-驗證”閉環(huán)。如今，這一工作流可以在Orbitrap高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)向Stellar PRM方法轉(zhuǎn)化中輕松實現(xiàn)，如圖1所示。Compound Discoverer™軟件和mzVault™ 軟件可以將高分辨質(zhì)譜DDA模式鑒定出的代謝物轉(zhuǎn)化為Stellar™ 質(zhì)譜兼容的PRM列表和二級質(zhì)譜庫（.msp），從而被TraceFinder™ 或Skyline™軟件用于代謝物定性定量工作。Skyline™軟件PRM Conductor 功能支持自動優(yōu)化scheduled PRM采集通道，降低共流出代謝物對掃描速度的影響。我們發(fā)現(xiàn)，相同血漿樣本在高分辨質(zhì)譜全掃描結(jié)果和Stellar PRM分析結(jié)果具有極高的重現(xiàn)性（篩選三針重復進樣CV<30%的feature），說明Stellar 質(zhì)譜可以對非靶發(fā)現(xiàn)的代謝標志物在大規(guī)模樣本水平進行驗證。

圖1 基于高分辨質(zhì)譜的Stellar PRM大規(guī)模代謝組學方法開發(fā)流程和結(jié)果展示（點擊查看大圖）

02

Stellar MS支持三重四極桿方法快速轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)同步定性定量

如果用戶既往已經(jīng)在三重四極桿質(zhì)譜平臺開發(fā)了擬靶向或廣泛靶向代謝組分析方法，Stellar™質(zhì)譜同樣可以實現(xiàn)原有方法的快速轉(zhuǎn)移。在保留時間可高度重現(xiàn)的前提(相同液相系統(tǒng))下，Stellar™質(zhì)譜儀可以直接將SRM/MRM列表轉(zhuǎn)換為PRM方法；即使保留時間在不同色譜系統(tǒng)上無法重現(xiàn)，用戶也可直接在Stellar™儀器上通過采集混標快速建庫，更新化合物保留時間和二級譜圖。與傳統(tǒng)SRM/MRM方法不同的是，PRM模式提供了待測物完整的二級譜圖，無需以犧牲代謝物的分析通量為代價而增加額外的采集通道，即可實現(xiàn)代謝物同步定性定量，進一步增強代謝物鑒定信心。（圖2）

圖2. Stellar PRM對高分辨質(zhì)譜采集到的代謝特征進行擬靶向分析（點擊查看大圖）

膽汁酸是膽固醇代謝的終產(chǎn)物，人體內(nèi)初級膽汁酸可由腸道菌群轉(zhuǎn)化為生物活性更高的次級膽汁酸，在生物體內(nèi)具有維持膽固醇平衡，調(diào)控糖脂代謝和炎癥反應等重要作用。我們將之前Thermo Scientific™ TSQ Altis™ 三重四極桿質(zhì)譜儀上構(gòu)建的膽汁酸定量方法，通過如圖3所示的流程快速轉(zhuǎn)移到Stellar™ MS上，實現(xiàn)了內(nèi)源性33種膽汁酸進行了同步定性定量。

圖3. 膽汁酸SRM/MRM列表PRM方法轉(zhuǎn)移和同步定性定量（點擊查看大圖）

03

Stellar MS支持擬靶向脂質(zhì)組學從頭開發(fā)，實現(xiàn)甘油三酯精確定量

脂質(zhì)因具有可預測的保留時間和二級質(zhì)譜，因此非常適合進行擬靶向分析。Skyline™軟件LipidCreator 功能可以生成脂質(zhì)各種加合離子的二級質(zhì)譜，直接用于擬靶向脂質(zhì)組學方法的從頭開發(fā)。脂酰肉堿（Acylcarnitine, AcCar）是哺乳動物體內(nèi)調(diào)節(jié)糖脂代謝平衡的關鍵物質(zhì)之一，不僅可以幫助脂肪酸穿梭進入線粒體進行β氧化，還可以與參與糖代謝調(diào)控酮體生成。研究證實脂酰肉堿與多種代謝性疾病密切相關，目前已廣泛應用于新生兒遺傳代謝病的臨床診斷。脂酰肉堿具有特定碎片離子(m/z 144, m/z 85, m/z 60，以及特定脂肪酸鏈中性丟失) ，可以直接利用LipidCreator預測得到。應用Stellar PRM模式，我們在血漿和尿液中分別鑒定出207和340種?；鈮A，如圖4所示。

圖4. Stellar PRM方法酰基肉堿鑒定情況

（點擊查看大圖）

04

Stellar MS支持多級質(zhì)譜聯(lián)合掃描，實現(xiàn)異構(gòu)體精確解析

脂質(zhì)分析中，存在三條脂肪鏈的甘油三酯(TG)定量尤其存在挑戰(zhàn)。例如，使用SRM/MRM模式定量TG(50:4)時，無論利用哪條脂肪鏈的中性丟失，都只能確定其中一條脂肪鏈的構(gòu)成，如使用FA16:0中性丟失碎片(m/z 573.7)定量只能證明該TG(50:4)存在FA16:0，但無法獲得其余兩條脂肪酸鏈的組成信息。而Stellar MS3可以精確定位TG的三條脂肪鏈組成，實現(xiàn)甘油三酯的準確定量（圖5）。

圖5. Stellar tMS3方法精確定量甘油三酯

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Stellar質(zhì)譜無需單獨設置MS3方法，即可直接與PRM模式并行用于代謝物定性定量，極大提升方法的靈活性。除對甘油三酯定量外，MS3還可用于同分異構(gòu)體的準確定量，如膽汁酸家族中的甘氨鵝脫氧膽酸 (GCDCA) 和甘氨脫氧膽酸 (GDCA), 可以在PRM定量同時，增加MS3通道提升其定量靈敏度和鑒定準確度（圖6）。

圖6. Stellar tMS3準確定量膽汁酸同分異構(gòu)體

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大規(guī)模代謝組學技術突破了傳統(tǒng)非靶向代謝組學數(shù)據(jù)冗雜和靶向分析覆蓋度低的局限，一次實驗可以獲得上千種代謝物的全面篩查，同時獲得比肩靶向分析的高靈敏度和高重現(xiàn)性。Thermo Scientific™ Stellar™質(zhì)譜的問世，標志著大規(guī)模代謝組學分析技術的一次革命性飛躍，它結(jié)合了四極桿質(zhì)譜出色的定量以及雙壓線性離子阱強大的定性能力，加速科研向臨床轉(zhuǎn)化的速度，極大推動代謝組學在臨床隊列研究、個性化營養(yǎng)代謝圖譜繪制等大規(guī)模樣本分析的應用場景，以更精準的數(shù)據(jù)揭示生命代謝的深邃奧秘。

參考文獻：

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5. Lauren Bishop, Brittany Lee, Charles Maxey, et al. Combining targeted MS2 and MS3 approaches for the quantitation of bile acids in biological specimens using the Stellar mass spectrometer. [PO]Thermo Fisher Scientific, Inc.

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